QPCR题库. _原创精品文档.pdfVIP

QPCR题库.

1.简述QPCR的原理，并写出其数学公式（不用写推导过程）。

任一样本q目的基因x达到阈值时分子数

Xqx=X0×(1+EX)ctx

任一样本q目的内标基因r达到阈值时分子数

Xqr=R0×(1+ER)ctr

Xqx=Xqr

X0×(1+EX)ctx=R0×(1+ER)ctr

X0/R0=(1+ER)ctr/(1+EX)ctx

对于一个小于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都

进行了适当的优化，扩增效率接近于1。

2.QPCR染料法与探针法的异同？

探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，

特异性高

染料类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，

简便易行。

SYBRGreenI是一种与双链DNA结合发光的荧光染料。所以可

以根据SYBRGreenI的荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链

DNA数量SYBRGreenI的最大吸收波长约为497NM，发射波长最大

约为520NM

优点：通用性较好，价格相对低廉，国内外科研中使用比较普遍。

缺点：由于SYBRGreenI不能识别特异的双链，对PCR反应中

的非特异性扩增及引物二聚体也会产生荧光，本底较高，临床应用时

会有假阳性出现

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它设计与目标序列上游引物

和下游引物之间的序列配对。

常用的荧光由FAM,TET,VIC,HET，荧光淬灭基团如TAMRA

荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整

的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接

近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进

行酶切，使

得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的

荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

Taqman探针检测的是积累荧光。当探针完整的时候，由于3?端

的荧光淬灭基团在吸收5?端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射

波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展

——TaqManMGB探针。

MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent

Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时

探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探针

的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可

以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针

设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况

下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于

富含A/T的模板可以区分得更为理想。

3.理论上来说，标准曲线的第一梯度和第二梯度的CT值，相差多

少？为什么。

答：相差-3.32,计算公式：Ct=-klgX0+b

4.在实验当中，我们要求R20.999，E在95~105%之间，这是

为什么？这两个值分别代表什么？如果扩增效率高说明什么问题？如

果低，说明可能存在的原因。

R20.999代表着标准品所构造的点在线性回归方程线上。。

扩增效率接近100％是优化的重复性好实验的最好标志，实际操

作时，反应的扩增效率应该在90％－105％之间，如果扩增效率低，

可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于

100％时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物

扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体