大肠杆菌基因表达系统.ppt

（2）-35区与-10区之间的距离（1）-35区和-10区的碱基顺序五、影响外源基因表达效率的因素1.启动子的结构对表达效率的影响5’-TTGACATATAAT一致顺序lactrp?PLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT5’-AGGAGGU-3’S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.翻译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？？？？AUG左侧的三个碱基也有影响。?-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。（2）起始密码AUG第八章大肠杆菌基因表达系统克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：外源基因01表达载体重组载体02原核细胞或真核细胞。导入宿主细胞03原核表达系统的注意事项不能直接用真核基因组DNA。必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。必须用cDNA或者是化学合成的基因。外源基因不能带有内含子。除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件：强启动子、强转录终止子可诱导性合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等理想原核表达载体具备的基本特征1AdividingE.coli2原核或噬菌体启动子3MCS4SD序列5终止子用温度或化学试剂诱导。基因工程常用的原核启动子最佳启动子必须具备的条件必须是一种强启动子应呈现低水平的基础转录应是可诱导型的乳糖启动子lacPlac目的基因OP1OtrpE目的基因色氨酸启动子trpcI857:噬菌体启动子是PL42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因28oC时阻遏PL，外源基因不转录。外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位形成原理未知。细胞质中表达包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。01使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞02回收的蛋白生物活性差。03缺点①优点容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。1周质（periplasm）2格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。3优点：2.周质中表达phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）（3）常用的原核信号肽①大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（2）信号肽（signalpeptide）一般位于N端。②金黄色葡萄球菌的蛋白A。鼠源RNase、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。（2）真核信号肽1用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；2使表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。3.胞外表达容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。缺点：优点：D序列产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。非融合型表达载体ATG-外源基因-TAG载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。四、几种类型的原核表达载体pKK223-3载体01必须选择一个有lacI的宿主菌。哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。组成结构：条件：020304tacPLacOS-D插入位点区rrnBT宿主lacI表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG分泌型表达载体如：pINIII系列：载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,Ompa：大肠杆菌外膜蛋白基因IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点组成结构Ipp：脂蛋白基因启动子以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.pINIII-comA1融合蛋白表达载体系统----pGEX系列优点表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。便于融合蛋白的分离和纯化。12