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君子忧道不忧贫。——孔丘
氨基酸的纸层析法
实验目的】通过氨基酸的分离1.学习氨基酸纸层析法的基本原理
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术
【实验原理】纸层析法(paperchromatography)是生物化学
上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分
的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层
析法,纸层析所用展层溶剂大多由有机溶剂和水组成。其中滤纸纤维
素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。因为滤纸纤
维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时,水是固
定相,有机溶剂是流动相。在层析时,将样品点在距滤纸一端约2~
3cm的某一处,该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的
一个方向进行展层,溶剂由下向上移动的称上行法;由上向下移动的
称下行法。这样混合氨基酸在两相中不断分配,由于分配系数(Kd)
不同,即不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同,所以利用在滤纸上
迁移速度不同分离氨基酸不同,氨基酸随流动相移动的速率就不同,
结果它们分布在滤纸的不同位置上而形成距原点距离不等的层析点。。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rateofflow,Rf)来
表示。所谓Rf,是指在纸层析中,从原点至氨基酸停留点(又称为层
析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:即原
点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和
层析温度等因素有关。在一定条件下,某种物质的Rf值是常数。
本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的,利用茚三酮
反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
【器材与试剂】
君子忧道不忧贫。——孔丘
1.氨基酸溶液:赖氨酸(lys)缬氨酸(val)脯氨酸(pho)混合氨基酸;
各5mL2.层析缸3.层析滤纸(新华1号)4.毛细管5.吹风机
6.烘箱7.喷雾器8.刻度尺9.铅笔10.表面皿11.培养皿12.展
层剂(扩展剂):水合正丁醇:醋酸=4:1,即将20mL正丁醇和5mL
冰醋酸放人分液漏斗中,与15mL水混合,充分振荡,静置后分层,
放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约10mL置于小烧杯中做平衡溶剂,
扩展剂20ml,13.显色剂:50~lOOmL0.1%水合茚三酮正丁醇溶
液。即0.5g茚三酮溶于100ml正丁醇,即得0.5%茚三酮一正丁醇溶
液,贮于棕色瓶中备用。
【实验步骤】
1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸:取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅
笔划一直线,在直线上每间隔2cm做一记号,标出5点。
3.点样:用毛细管将各氨基酸样品点在5点上,用量10~
20μl,每点
在纸上扩散的直径,最大不超过3mm,边点样边用电吹风吹干,
越小越好。干后再点一次。
4.扩展用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20
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