番茄绵疫病菌抗药性检测技术规程.docxVIP

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标准名称

1范围

本标准规定了番茄绵疫病菌抗药性检测的术语和定义及检测方法。

本标准适用于番茄绵疫病菌对杀菌剂的抗性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB16715.3瓜菜作物种子第3部分：茄果类

GB12475农药贮运、销售和使用的防毒规程；

NY608农药产品标签通则；

NY/T496肥料合理使用准则通则；

NY/T1276农药安全使用规范总则；

NY/T2118蔬菜育苗基质。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1原药Technicalgradematerial

未经加工的农药原产物。

3.2抗药性fungicideresistance

有害生物群体对农药产生敏感性下降的遗传变化称为抗药性。

3.3抑制中浓度（EC50）Medianeffectiveconcentration（EC50）

指在试验时间内，抑制50%菌丝生长或孢子萌发所需的药剂有效浓度。

3.4番茄绵疫病tomatobrownrot

指由疫霉属辣椒疫霉[PhytophthoracapsiciLeonian]侵染番茄引起的一种流行性病害。

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3.5敏感基线sensitivitybaseline

在同类作用方式的杀菌剂使用之前，靶标病菌群体中不同菌株对一种药剂的敏感性(EC50值)分布

曲线，常用平均值及95%置信限表示。

3.6人工接种artificialinoculation

在适宜条件下，通过人工操作将菌饼置于含药的平板中央，通过菌丝生长速率来检测病菌的抗药性

水平。

4测定方法

4.1菌丝生长直径法

将能明显抑制菌丝生长的供试药剂（烯酰吗啉、霜脲氰、嘧菌酯、氟吗啉、霜霉威、精甲霜灵、百菌清等及其混剂）与培养基混合，以菌丝生长速率快慢来检测番茄绵疫病菌对药剂的抗性水平。试验时，先进行预备测定，将各待测菌株移入含上述杀菌剂0.1、1.0、10、100μg·mL-1的培养基平板中培养7d，

根据其生长情况设计正式测定时的杀菌剂系列浓度梯度。

4.2培养基的制备

4.2.1基础培养基

取50g黑麦种子在适量去离子水中浸泡24h～36h，捣碎机捣碎，55℃~60℃水浴1h～2h，双层纱布过滤，55℃~60℃水浴1h～2h，双层纱布过滤，上清液补水至1000mL，加入琼脂15g，121℃高压

灭菌30min。

4.2.2选择性培养基

待基础培养基冷却至50℃~60℃时，加入利福平20mg．L-1，氨卞青霉素200mg．L-1，70%五氯硝基苯

100mg．L-1，充分摇匀后倒入培养皿中。

4.3绵疫病样的采集、分离和保存

4.3.1菌株的采集

在田间选择刚发病的番茄叶片，装入一次性小塑料袋内，置于冰块中，1天内带回实验室进行分离。

4.3.2病原菌的分离

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将采回的病叶用自来水和灭菌水冲洗干净，凉干后，背面朝上置于灭菌过的2%琼脂培养基上，16℃~20℃培养箱内光暗交替（12h/12h）保湿培养4～5d，发病后挑取霉层置于选择性培养基上，16℃~20℃

培养8d～10d(菌落直径长至2cm～3cm)。

4.3.3绵疫病菌的鉴定

挑取少量分离纯化的菌丝制成玻片，在100倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录A相符时，则

确定所分离的病菌为绵疫病菌。

4.3.4病原菌的保存

挑取分离出来的绵疫病菌少量菌丝置于选择性培养基上，在培养箱中16℃~20℃黑暗培养2d～3d，再将菌落边缘单菌丝的尖端连同培养基一起切下，置于斜面基础培养基上，16℃~20℃黑暗培养14d后，

加入灭菌过的石蜡油（液面超过菌面约1cm），10℃黑暗保存，备用，每半年转接1次。

4.4含药培养基的制作

收集杀菌剂原药，保存于避光、低温（0℃~4℃)及干燥条件下。

称取适量的原药，用有机溶剂（如丙酮、甲醇、二甲亚砜等）溶解，以无菌水稀释成母液（有机溶剂的含量应低于总体积的1%），再加入无菌水稀释成系列浓度的药液，按照药液与培养基体积比1:9分别加入溶化的黑麦琼脂培养基（RA）中，混匀，泼碟，配制成含不同浓度药剂的RA平板。对照仅加入适

量DMSO或丙酮等溶剂。

4.5接种及培养

将保存的菌株取出活化，然后在RA平板上培养10d，从菌落边缘以直径5mm打孔器打菌饼，用接种针挑取菌饼接在含药RA平板（直径9cm)中央，以不含药RA平板为对照，