实验二SDSPAGE凝胶电泳.ppt

考马斯亮蓝染色常用染色方法银染法金属离子染色法以考马斯亮蓝染色为例染色剂考马斯亮蓝马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。4℃，1～2月10%SDS（十二烷基磺酸钠）1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.9)：称取Tris18.2g,加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。010302试剂配制实验步骤1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8):称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100mlTEMED（四甲基乙二胺）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml（12）高分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌动蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶MW=14,400

置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。（13）样品：兔血清配制10％过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。01待凝胶溶液平衡至室温(23~25℃)后，真空脱气15min。04将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。02将灌胶装置准备好。03２.聚胶前准备安装膜具将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后灌胶。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶

制备分离胶30%丙烯酰胺5ml+分离胶缓冲液5ml+10%SDS0.2ml+10%过硫酸铵0.2ml+蒸馏水9.6ml；混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用移液管加入1-2cm的蒸馏水，静置，待凝胶聚合后（约30min），去除水相，然后用吸水纸吸干残余的水。制备浓缩胶0130%丙烯酰胺1.32ml+浓缩胶缓冲液1ml+10%SDS0.08ml+10%AP0.08ml+蒸馏水5.6ml；混匀后加入8ulTEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。02010203