novel-miR339-5p靶向GNBPA1和SPB15介导白纹伊蚊免疫绿僵菌侵染的机制.pdf

摘要

白纹伊蚊称为亚洲虎蚊，是多种疾病的传播媒介，至少传播22种虫媒病毒，是

登革热不同血清型的重要媒介，给人类健康带来威胁，防蚊控蚊是预防蚊媒传染病重

要环节。但是长期的化学农药使用使白纹伊蚊对不同种类的化学杀虫剂有不同的耐药

性。绿僵菌在过去已被用于商业防治不同种类的害虫和蚊子。但绿僵菌与白纹伊蚊免

疫系统的相互作用机制研究至今仍不清晰。本研究根据实验室测定了绿僵菌侵染白纹

伊蚊不同时间（24h、48h和72h）后测定脂肪体的全转录数据库。生物信息学筛选

到了162个免疫基因，包括Toll、Imd和JAK/STAT免疫信号通路；利用RNAhybrid，

miRanda和TargetScan三种软件建立了靶基因的预测，共预测到2168个靶基因。为

了进一步研究白纹伊蚊中差异miRNA免疫基因的调控关系。本研究将围绕

novel-miR339-5p如何调控GNBPA1和SPB15两个基因的表达，研究结果如下：

（1）绿僵菌入侵白纹伊蚊后的观察。显微镜下可以观察到绿僵菌入侵白纹伊蚊

孢子；利用琼脂孔穴法检测了绿僵菌入侵白纹伊蚊后，抗菌肽的活性强弱。中肠切片

结果显示，绿僵菌入侵白纹伊蚊后可以破坏中肠。

（2）利用RT-qPCR检测了绿僵菌侵染后白纹伊蚊脂肪体中关键免疫相关基因的

验证。9个关键免疫相关基因包括GNBPA1、SPB15、Spaetzle、Toll、Dorsal、MyD88、

CeropinC、DefensinC、Gambicins-like。RT-qPCR进一步检测了novel-miR339-5p和靶

基因GNBPA1和SPB15的表达模式。绿僵菌侵染白纹伊蚊24h、48h和72h后，

novel-miR339-5p表达先上调后下调。在侵染48h，novel-miR339-5p和靶基因GNBPA1

和SPB15的表达趋势正好相反。

（3）RT-PCR克隆了白纹伊蚊GNBPA1和SPB15两个基因的CDS序列，RT-qPCR

对其时空表达模式进行研究。

（4）细胞水平上验证novel-miR339-5与靶基因GNBPA1和SPB15的调控关系。

将novel-miR339-5p模拟物mimic与psi-CHECK2-GNBPA1或psi-CHECK2-SPB15共

转染到HEK293T细胞48h后，进行荧光素酶检测。结果表明novel-miR339-5p负调

控靶基因GNBPA1和SPB15的表达。

（5）miRNAnovel-miR339-5p的体内功能验证。体外合成novel-miR339-5p的

mimic和inhibitor，显微注射到白纹伊蚊体内。白纹伊蚊在感染绿僵菌后，

novel-miR339-5pmimic注射后蚊子的死亡率明显高于NC注射的蚊子。进一步检测了

I

蚊子体内真菌的增殖。发现注射novel-miR339-5pmimic可导致蚊子体内的绿僵菌数

量显著增加。

（6）利用RNAi技术进一步研究GNBPA1和SPB15基因在白纹伊蚊体内的功

能。体外合成GNBPA1和SPB15dsRNA，利用显微注射技术实现靶基因的沉默，

GNBPA1基因的表达量下降率在注射dsRNA后12h可达85%。发现白纹伊蚊注射

了dsGNBPA1和dsSPB15后，大大增强了白纹伊蚊对真菌感染的敏感性；白纹伊蚊

的存活率显著降低。PO活力表明，在侵染初期注射dsSPB15组PO活力明显低于dsGFP

对照组，72h以后则无明显差异。

综上所述:明确并阐明了novel-miR339-5靶向GNBPA1和SPB15基因调控了白

纹伊蚊抗菌肽基因的表达和酚氧化酶的活性，从而介导白纹伊蚊免疫防御绿僵菌侵染

的机制。研究结果为miRNA在蚊子先天免疫反应中的调节功能提供了新的见解，有

助于开发环境友好的蚊子防控策略。

关键词：蚊子；昆虫病原真菌；miRNA；免疫

II

英文缩略词

英文缩写全称中文名称

AmpAmpicillin