PGC介导的TMEM182基因编辑研究及其基因敲除性腺嵌合体鸡的制备.pdf

摘要

鸡肉作为一种价廉质优的蛋白质来源，是我国仅次于猪肉的第二大肉类消费品。

在家禽生产中，产肉量和肉质是影响经济效益的重要指标，前者主要受肌肉发育影响，

后者则受到肌内脂肪分布和脂质沉积的影响。

前期研究发现，新型跨膜蛋白TMEM182特异表达于鸡的肌肉组织和脂肪组织，

通过抑制成肌细胞分化及融合、参与鸡脂肪的合成代谢，从而影响鸡的成肌成脂过程。

因此，利用基因工程对鸡TMEM182基因进行遗传修饰，对于培育高产优良的肉鸡新

品种，大幅缩短育种年限具有重要意义。

原始生殖细胞（PGCs）是精子/卵子的前体细胞，能将遗传信息传递给后代。将

PGCs经过体外培养以及基因修饰后，移植到受体鸡胚内产生性腺嵌合体，是制备基

因编辑鸡的一个理想方法。

在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑工具对鸡原始生殖细胞(PGCs)的

TMEM182基因进行敲除，以期制备TMEM182基因缺陷的性腺嵌合体鸡。

首先，为了研究鸡TMEM182基因的进化特征，我们对家禽和哺乳类动物共计8

个物种的TMEM182基因的DNA序列、mRNA序列以及蛋白序列进行同源性分析，

绘制了系统进化树。结果显示：在各物种间，TMEM182的蛋白序列高度保守，mRNA

次之，据此推测TMEM182蛋白在不同物种间能够发挥相同的功能。采集鸡胚的心、

肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、脑、腹脂等组织，用qPCR检测TMEM182基因在鸡

胚发育早期不同组织的相对表达量，发现TMEM182基因特异表达于腿肌、胸肌和腹

脂中，说明TMEM182基因从鸡胚发育早期就参与成肌成脂过程。

其次，我们从发育至Hamburger-Hamilton(HH)的28-30阶段鸡胚中分离出PGCs，

经过体外培养后，利用PAS染色、免疫荧光化学染色、RT-PCR等方法对其鉴定，同

时也对其性腺迁移能力进行鉴定。结果表明，PGCs在体外培养的过程中仍能保留其

生物学特性。

随后，为提高CRISPR/Cas9的打靶效率，我们针对TMEM182基因的第二外显子

选择3个sgRNA,在DF-1细胞上进行打靶效率验证，其中TMEM182-sgRNA1的打靶

效率最高。此外，为提高基因编辑的安全性和精确性，我们用基于碱基替换的策略在

TMEM182基因提前引入终止子，实现TMEM182基因敲除。

最后，制备TMEM182基因缺陷的性腺嵌合体鸡。为了便于追踪，我们通过HMEJ

I

基因整合策略将外源基因mCherry定点插入到PGCs的TMEM182基因的第二外显子

区，造成TMEM182基因的插入突变，通过流式分选，得到能稳定表达红色荧光的

mCherry＋PGCs，将其注入到发育至2.5d的受体鸡胚。注射后第4.5天，采集受体鸡

+

胚的性腺，可观察到性腺存在大量的mCherry细胞；另一部分鸡胚继续孵化至出壳，

最终得到10只小鸡。以上结果表明，本研究成功获得了TMEM182基因缺陷的性腺嵌

合体鸡。

关键词：鸡；CRISPR/Cas9；PGCs；TMEM182；基因编辑

II

英文缩略词

英文缩写英文全称中文全称

μgMicrogram微克

μLMicroliter微升

bpBasepair碱基

CRISPRClusteredRegularlyInterspacedShort间隔短回文重复序列

PalindromicRepeat

dDay