实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.pptVIP

实验八SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质一、目的要求学习电泳原理和技术学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。原理聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；对pH和温度变化较稳定；几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)

样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3返回图2夹心垂直板电泳槽示意图

图3凝胶模示意图

样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框

样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应图4电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。图5不连续系统浓缩效应示意图SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小