生物化学第四章蛋白质的共价结构.ppt

示例(十肽的水解)（七）肽段在多肽链中次序的决定A法水解得到四个小肽：A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到四个小肽：B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val重叠法：Ala-Phe-Gly-Lys－Asn-Tyr-Arg－Tyr-His-Val（八）二硫桥位置的确定一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val?-OrnL-Orn?-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu?菌肽S(环十肽)?由三、蛋白质一级结构的测定2005-12-14台州学院生命科学与医药化工学院柯世省蛋白质的一级结构指多肽链中的氨基酸序列。（一）蛋白质测序的策略(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。(2)拆分蛋白质分子的多肽链。(3)测定多肽链的氨基酸组成。(4)分析多肽链的N末端和C末端残基。(5)断裂多肽链内的二硫键。(6)多肽链断裂成肽段。(7)测定各个肽段的氨基酸顺序。(8)确定肽段在多肽链中的次序。(9)确定原多肽链中二硫键的位置。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质蛋白质顺序测定基本方法路线2005-12-14台州学院生命科学与医药化工学院柯世省N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定N-末端分析DNFB法；DNS法PITC法氨肽酶法C-末端分析肼解法；还原法羧肽酶法Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。N末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法N末端基氨基酸测定在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。丹磺酰氯法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。N末端基氨基酸测定氨肽酶(aminopeptidases)法肼解法C末端基氨基酸测定此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。C末端基氨基酸测定此法是多肽链C-末端氨基酸分析法。多肽与LiBH4在无水条件下加热，C-端氨基酸被还原为醇即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则不变。醇很容易与其余氨基酸分离。LiBH4法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。C末端基氨基酸测定羧肽酶(carboxypeptidase)法（三）二硫桥的断裂断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。ssHCOOOHSO3HSO3HSSSSSS胰岛素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHS