细胞培养-原代培养-传代培养.ppt

培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-渗透压无污染无毒超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸01CO2培养箱02倒置显微镜03酶标仪、微孔板震荡器04液氮罐05自动双重纯水蒸馏器，纯水仪06耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管07常用仪器设备压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广1电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃2器皿消毒3滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、4酶液等均采用滤过法除菌5超净工作台：为细胞操作提供无菌环境6紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料7培养皿和培养板等表面消毒8超净台logo超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器CO2培养箱1CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。2使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：3用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。4保持培养箱内空气干净。定期消毒5（90℃，14h)。6箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器纯水仪酶标仪微孔板震荡器培养器皿CultureflaskCulturePlate浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、01流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干02常用玻璃器皿清洗清洁液的配制细胞培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便干粉培养基和液体培养基RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等常用的培养基种类培养基的选择没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。热灭活（heat-inactivation）是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质1234血清使用注意事项凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。血清沉淀