乙型肝炎病毒核苷（酸）类似物耐药的检测.ppt

乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测缪晓辉2009.5

一、HBV耐药的有关定义病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）

HBV耐药的有关定义病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。

HBV耐药的有关定义病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。

HBV耐药的有关定义生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。

HBV耐药的有关定义HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。

HBV耐药的有关定义HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50＞10倍:耐药

HBV耐药的有关定义临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。

病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测

病毒学反跳或突破的监测

HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用

基因型耐药相关变异的命名

基因型耐药相关变异

在HBV多聚酶序列中的位置

直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大减少。④测序能力增强。

HBVYMDD变异直接测序结果图谱

直接DNA测序的局限性

克隆测序法

克隆测序法

碱基变异可能导致：①原有位点消失②产生新的位点③识别位点移位利用错配引物使PCR产物中产生特异的酶切位点结果:酶切片段长、短变化和多、少变化

限制性内切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：NdeI限制酶的识别序列和切割位点：CATATGGTATACNlaIll限制酶的识别序列和切割位点：CATGNNNGTACNNN

PCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR错配引物设计

PCR-RFLP检测HBVYMDD变异

PCR-RFLP检测HBVYMDD变异

INNO—LiPA诊断HBVYMDD变异

BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis

DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2