spra和sprb在锦鲤体色中的功能研究.pdfVIP

摘要

锦鲤（CyprinuscarpioL.）具有多种颜色和图案，是研究体色机制的代表物种之一。

目前，对锦鲤体色的研究大多集中在黑色素细胞上。关于黄/红色素细胞分化、迁移和

色素沉着的研究以斑马鱼（Daniorerio）和青鳉（Oryziaslatipes）等模式鱼类为主。SPR

（sepiapterinreductase）是一种催化BH生物合成的酶，在人类和小鼠中的研究多集中

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在生理和病理方面，其在色素细胞分化和体色形成中的研究较少。即使在斑马鱼、青鳉

等模式生物中，也仅是证实spr在黄色素细胞中表达，对其功能的研究尚未见报道。硬

骨鱼类经过鱼类特有的基因组复制，存在spra和sprb两个旁系同源基因。鉴于锦鲤色

素细胞类型与斑马鱼等模式生物的差异，有必要对两个旁系同源基因在锦鲤体色形成中

的功能进行深入解析。

本论文首先克隆获得了锦鲤spra和sprb的全长cDNA，其次通过实时荧光定量

（QuantitativeReal-timePCR，qPCR）、免疫双荧光、westernblot检测了两者在锦鲤组

织中的mRNA和蛋白表达情况及定位；之后克隆了锦鲤spra和sprb的启动子序列，并

进行了相关分析；随后通过SFD（sulfapyridine）抑制剂处理锦鲤幼鱼，利用qPCR、表

型观察、冰冻切片、westernblot和免疫双荧光等方法进一步研究spra和sprb在锦鲤体

色形成中的功能；最后借助CRISPR/Cas9技术对spra和sprb的功能域进行编辑，构建

了spra、sprb单、双突变嵌合体，进一步分析spra、sprb之间的功能差异。

1、锦鲤spra和sprb序列克隆、进化及表达分析

本章采用RACE技术获得了锦鲤spra和sprb的全长cDNA，对两者的氨基酸序列

进行比对和系统进化树分析，并检测了spra和sprb的时空表达差异。锦鲤spracDNA

全长1792bp，其中ORF（openreadingframe）783bp，编码了261个氨基酸（aminoacids，

AAs），5′UTR为65bp，3′UTR为941bp，启动子为1864bp。锦鲤sprbcDNA全长

1149bp，ORF是810bp，编码270个AAs，5′UTR为43bp，3′UTR为293bp，启动

子为1946bp。锦鲤spra和sprb都具有一个adh_short结构域（adh_shortdomain）。系

统进化树显示，只有硬骨鱼类中的spr出现了基因组特异性复制，在两栖动物、爬行动

物、鸟类和哺乳动物中只观察到一个spr。

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对spra和sprb启动子序列进行分析发现，预测的核心活性区域和CpG岛位置不一

致。此外，锦鲤spra和sprb启动子包含多个反式作用因子。锦鲤spra和sprb均含有3

个外显子和2个内含子。锦鲤spra分布在A3号染色体上，锦鲤sprb分布在B8号染色

体上。纯红锦鲤发育至出膜后4天（dayposthatched，dph）时spra的表达量最高，而

sprb在1dph时表达量最高。spra在皮肤、鳍条和鳞片等色素细胞富集的区域显著表达，

而sprb广泛分布在所有组织中。

2、spra和sprb的多克隆抗体制备及其在锦鲤组织中的表达与定位

本章分别获得了鼠抗鱼spra多克隆抗体和兔抗鱼sprb多克隆抗体，westernblot证

实抗体具有特异性，目的蛋白大小与预期一致，分别约为28kDa和30kDa。免疫双荧

光、westernblot与qPCR结果基本一致。spra在纯红和纯白锦鲤表皮层高表达，并且红

色皮肤真皮下层的阳性信号较白色皮肤更强。sprb在白色皮肤表皮层和基底层的阳性信

号较红色皮肤强。westernblot显示，spra在红色鳍条和鳞片中高表达，sprb在白色组织

中高表达。

3、锦鲤spra和sprb的功能研究

本章开展了SFD抑制剂实验，预实验确定了最适灌喂剂量为100mg/kg，最佳灌喂

时间为三天一次。随后开展了60天的长期灌喂实验。实验