酶的来源与筛选.ppt

第三章酶的筛选

酶的来源与多样性可以通过两条途径化学合成，包括酶的化学全合成、模拟酶的化学合成。生物合成，从生物中提制。少数来自于动植物，多数（80%以上）来源于微生物；种类繁多，易筛选：凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到．并可根据应用特点和要求，筛选出最佳的产酶菌株；繁殖快，发酵周期短，培养简便，能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量；微生物具有较强的适应能力，可采用各种遗传变异手段，培育出新的、更理想菌株。010302微生物作为酶源的优点：生物已知种类估计总的种类所占百分率细菌4760800000～30000000.2%-0.6%古细菌＜50050000～5000000.1%-1%真菌6900015000005%病毒5000130000?4%微生物多样性赋予的酶开发的巨大开发潜力不可培养微生物：指在实验室内,采用常规培养方法培养不出的微生物。（占全部微生物的99%）01绕开菌种分离、纯化的步骤，应用分子生物学方法，直接从中寻找有开发价值的、新的微生物酶基因和新的酶种。02耐有机溶剂微生物2mol/Ｌ）]；嗜极端环境微生物嗜热微生物（250～350℃）；嗜冷微生物（-10～0℃）；嗜酸微生物（pＨ0）；嗜碱微生物(pＨ11)；嗜盐微生物[饱和食盐溶液（含盐32%或酶的寻找和发现应过程的设计选择合适的合成的反应途径、反应底物或原料底物：价廉、易合成酶：是否易得、活性、稳定性。资料查阅：是否有已确定的能转化该反应的或相似反应的酶。氨基酸生物合成的多条途径brenda(http://www.brenda.uni-koeln.de/)大量关于酶的信息：包括酶的分类，序列、结构、功能、特性（稳定性、最佳pH、最佳反应温度）、底物\产物、催化的反应，代谢途径，抑制剂、激活剂，辅助因子等Ligand数据库包含了化合物（除常规代谢途径的化合物外还包括其他化合物、如：药物、多糖）、酶、反应。Biocatalysis/biodegradation代谢途径和生物转化，主要包含代谢途径、反应、化合物、酶。获得新酶的方法01筛选新酶：从自然环境中；02发现现有酶的新活力（非自然）；03利用新的反应条件，如改变反介质，或新的影响因素（如金属离子）；04酶的改造，主要指利用基因工程技术，突变酶,定向进化；05人工酶。062.酶的寻找脂肪酶的催化混杂性脂肪酶的催化混杂性1从商品酶库中筛选3从自然界发现和筛选产酶微生物2从已知菌种来源和菌种保藏中心筛选4从基因库筛选3.酶或产酶微生物的筛选从自然界筛选产酶微生物一般步骤：01040203采样：生物多样性环境；高选择压力环境（针对与工艺条件相似的环境）。富集培养：取其所好，投其所抗。分离：稀释涂布、划线分离。筛选初筛：最普通的筛子——快速简单，筛去大部分非目标株，尽量保留有潜力的候选株。1）琼脂板涂布法筛子：以底物或底物类似物为唯一的碳、氮原；底物的转化或产物的形成在琼脂培养皿上产生的半透明圈。产物的衍生化或络合：衍生化或络合试剂与产物的某些功能团形成呈色圈。色原性底物：通过酶催化时颜色的变化,对菌群进行可视的直接鉴定。指示菌株：对产物能显示某种生理变化，如生长、或不生长。水解酶活性检测中最常用的色原性底物-对硝基苯基衍生物脂肪酶—对硝基苯酯蛋白酶—对硝基苯酰胺糖苷酶—对硝基苯糖苷对硝基苯糖苷水解释放黄色对硝基苯酚或苯胺01试卤灵（resorufin）,1-萘酚衍生物。03缺点：只能模拟目标真实底物。02荧光底物-伞形酮（umbelliferone）作为内置荧光团的衍生物其他常用的发光底物氧化还原酶活性检测NAD(P)H在340nm的吸光度可用于检测信号。基于NAD(P)H生成的比色法间接法：四唑氮蓝（NBT）/吩嗪硫酸甲酯（PMS）法，在PMS存在下，NAD(P)H与黄色的NBT反应，可生成蓝紫色甲臜（formazan），吸收波长：580nm。234101ABTS(2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)检测法过氧化物酶02邻联茴香胺-氧化呈红色。ABTS可被过氧化物酶氧化呈浓绿色需有吸光度的变化，可见，或荧光。微孔板悬浮法01Freeman等人设计的微珠固定化方法,通过物理手段使单个细胞附着在单个聚丙烯酰胺固体。.4）流式细胞计数法细胞通过高速流动系统,排成单行,逐个流经检测区进行。微珠细胞固定化法02复筛：特定筛——慢、精确。使用准