大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.pptVIP

重组质粒的转化;在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的转移基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，称感受态细胞。;转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。;;RbCl(KCl)法，CaCl2法，电击感受态制备等

RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但制备较复杂

电击感受态细胞转化效率高,但需电击仪

CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.;CaCl2法基本原理是：细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，

倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。;1）感受态细胞的状态：

制备感受态细胞时不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。;2）质粒的质量和浓度:

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。

一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。;1）材料

低温保存的感受态细胞：由E.coliDH5α菌株制备；

质粒DNA:实验室保存;1.LB液体培养基： 称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2.LB固体培养基： 液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌后制备平板。

3.Amp母液： 氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液,-20℃保存备用。

4.含Amp的LB固体培养基: 将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp母液,使终浓度为100ug/ml,摇匀后制备平板。;三.操作步骤;热激转化;对照组1:

以同体积的无菌水代替DNA溶液,但涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。证明感受态细胞的活性。

对照组2:

以同体积的无菌水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。证明感受态细胞没有其它杂菌的污染。