肝素酶活性的测定 编制说明.docx

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《肝素酶活力的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明

（一）工作简况

1、任务来源

本标准根据国标委公布的2023年国家标准计划项目，本项目计划编号为T-469，名称为《肝素酶活力的测定分光光度法》。

本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。

2、目的和意义

肝素酶可以催化肝素或者硫酸乙酰肝素的裂解反应，分为肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,其最重要的用途之一是酶解肝素制备低分子量肝素，而低分子量肝素是最重要的抗凝血药物之一。

肝素酶的酶活性是其质量的重要指标之一，鉴于目前我国并无统一的肝素酶活性测定的方法标准，产品的实际酶活性和包装标识的酶活性是否一致还缺乏相关的标准进行规范约束和验证，因此研制肝素酶活性的测定标准将为肝素酶的生产、流通及监管提供依据，促进我国肝素行业以及肝素酶相关医药行业的健康发展，具有非常重要的现实意义。

3、协作单位

本标准由清华大学主持，河北省食品检验研究院、中国测试技术研究院等单位联合起草。

4、标准编制过程和主要工作过程

（1）2022年05月至11月，标准起草单位组织相关技术人员对《肝素酶活力的测定分光光度法》标准项目进行了预研，起草组成员查阅资料，广泛收集国内外近百余篇标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排。

（2）2022年12月，标准起草单位在收到全国生化检测标准化技术委员会项目征集通知后，提交了项目申报书以及国家标准草案工作组讨论稿。

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（3）2023年12月，收到全国生化检测标准化技术委员会文件《关于下达2023年推荐性国家标准计划的通知》（生检标[2023]41号），《肝素酶活力的测定分光光度法》标准项目立项，计划编号T-469。

（4）2024年1月至2024年12月，进行标准的起草研制工作。完成了《肝素酶活力的测定分光光度法》标准（征求意见稿）及其编制说明，并对全国生化检测标准化技术委员会汇报了标准（征求意见稿）的研制及修改情况，向全国生化检测标准化技术委员会提交了标准（征求意见稿）和编制说明。

5、国家标准主要修订人及其所做的工作

本标准由清华大学主持，河北省食品检验研究院、中国测试技术研究院等单位联合起草。

（二）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容

1、标准编制原则

本标准的编制依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》，并参照了GB/T6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分总则与定义》、GB/T6379.2-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》、GB/T35538-2017《工业酶制剂测定技术导则》。

2、确定国家标准主要内容

本标准描述了肝素酶活性的测定方法。

本标准适用于生化试剂肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的测定。

（三）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果

1、原理

肝素酶催化底物肝素或硫酸乙酰肝素裂解会生成4,5不饱和糖醛酸。4,5不饱和糖醛酸在232nm波长下有特征吸收（图1），通过测定232nm下的吸光度的变化，结合4,5不饱和糖醛酸的摩尔消光系数，计算酶活性。

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图1肝素酶催化生成的4,5不饱和糖醛酸的全波长扫描图

2、肝素酶酶活性测定方法的确立

由于酶的活性会受到温度、pH以及离子添加剂等多种参数的影响，因此选取不同温度、不同pH、不同CaCl2浓度条件对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性进行测定，以确定酶的活性测定方法中的各项重要参数。此外，反应时间也会影响酶活性测定的结果，因此该参数也需在方法中确立。

2.1反应温度的确定

肝素酶等酶的催化作用受温度的影响很大，一方面提高温度可以增加酶促反应的速度，另一方面酶的化学本质是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。

不同温度对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影响如图2所示。肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅱ的最适催化温度为30℃,而肝素酶Ⅲ的活性在20℃-40℃的范围内随温度提高而缓慢提高，综合考虑三种肝素酶的热稳定性，选取30℃为肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性测定温度。

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图2肝素酶的酶活性随温度的变化

2.2反应pH的确定

反应体系pH值对于肝素酶等酶的活性影响很大，pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也能影响底物的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化。而当pH过小（过酸）或者过大（过碱）都有可能使蛋白变性而失活。

不同pH对肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影响