质粒DNA提取鉴定.ppt

质粒DNA提取、鉴定暨大医学院生化教研室蒋建伟质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子（补充：部分质粒为RNA）。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。质粒分类：一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。严紧型（每个细胞1－5个质粒），当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次；松弛型（每个细胞10－200个质粒）。如果用一定的药物处理还会使质粒拷贝数增至几千份。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。0102030405pBR322质粒(4363bp):主要包括：限制性内切酶位点（插入外源基因）；含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。(插入失活法)抗药性标记选择四环素抗性基因（Tetr）失活pUC质粒:含E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为β半乳糖苷酶的α片段。Lac－E.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的ω片段.单独存在的α或ω片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有β半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（α-互补)。M13噬菌体：M13mp系列pUC系列α互补的检测α片段ω片段α片段ω片段BCA有HindⅢ,BamHⅠ酶切点，可切出CD基因（1.2kb）大肠杆菌＋pEC-ct质粒，pEC-ct质粒：8.0kb(6.8kb)ACB本实验：细菌培养和质粒扩增01菌体收集02菌体裂解、质粒DNA提取、纯化03鉴定2人一组04本实验包括：细菌的培养接种：从-20℃取出菌种，斜面划线接种，37℃培养24h单克隆培养：挑单个菌落，接种于LB培养液中（含Amp50μg/ml)4-6h。菌液0.2ml＋10mlLB培养基（含Amp50μg/ml)37℃培养过夜。周四：00每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。[操作]扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50μg/ml),振摇200rpm，37℃(4-6h),使A580＝。加氯霉素：加氯霉素，终浓度40μg/ml，继续培养15-17h.周五P.M.由林春兰老师完成。周五A.M.10:00每小组来一个代表，在林春兰老师指导下完成。0102周六8:00.去医学院7楼，2人/份收集菌体↓9000rpm2-3min↓↘弃上清取6个1.5mlEppendorf管，分别加细菌培养液1.4ml01再用200μlSTE液清洗各管，清洗液合并上管（收集菌体）↓9000rpm2-3min,弃上清（保留菌体）600μlSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管02沉淀DNAKAc-HAc裂解碱裂解法提取质粒DNARNase↓放置5min3。沉淀悬于200ul溶液I，混匀↓放置5min4。加入400ul溶液II，颠倒混匀数十次（20～30次）0.2NNaOH-1%SDS↓10min5。加入300ul溶液III，充分混匀（温和操作）12000rpm3min↓↘弃沉淀6。将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540ul)，倒转混匀↓室温5min离心12000rpm10min↓↘弃上清沉淀干燥，室温5min↓7。加TE500ul溶解沉淀同时倒胶1%,330ml/小班沉淀质粒去除基因组DNA和蛋白8。加入等体积饱和