中成药中大米源性成分检测-PCR法（征求意见稿）.docx

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中成药中大米源性成分定性检测方法PCR法

1范围

本文件规定了中成药中大米源性成分检测的PCR方法。

本文件适用于中成药中大米源性成分的检测。本方法的检出限为0.1%。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

PCR法（PolymeraseChainReactionMethod）

聚合酶链式反应，指在PCR体系中加入扩增预混液，利用核酸电泳技术检测PCR扩增结果。

3.2

核酸电泳技术（NucleicAcidElectrophoresisTechnology）

利用核酸电泳技术鉴定PCR结果。

3.3

基因克隆及测序技术（GeneCloningandSequencingTechnology）利用基因测序仪确定DNA序列。

4原理

利用裂解液提取中成药中大米源性DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR阳性产物采用克隆测序进行确证。

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5试剂与材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求。5.1DNA提取用试剂

5.1.1大米源性鉴别引物：5TTAGCCTCCCGCTGCAGA3和5AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3；

5.1.2阳性对照：用市售大米样品做阳性对照；

5.1.3超纯水；

5.1.4琼脂糖：电泳纯；

5.1.5乙醇；

5.1.6溴化乙锭；

5.1.7异丙醇；

5.1.8氯仿；

5.1.9Tris-HCl；

5.1.10EDTA.2Na·2H2O；

5.1.11十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；

5.1.12氯化钠（NaCl）；

5.1.13硼酸；

5.1.14氯化镁（MgCl2）；

5.1.15浓盐酸；

5.1.16氢氧化钠；

5.1.17溴酚蓝。5.2溶液配制：

5.2.170%乙醇：取70ml乙醇（5.1.5）与30ml超纯水混匀（5.1.3）；

5.2.2氯仿/异戊醇（24：1）抽提液：取24ml氯仿（5.1.8）和1ml异丙醇（5.1.7），混匀；

5.2.31mol/LTris-HCl（pH8.0）：称取Tris-HCl（5.1.9）121.1g溶解于约800ml超纯水（5.1.3）中，加浓盐酸（5.1.15）或氢氧化钠（5.1.16）调节溶液pH值至8.0，用超纯水（5.1.3）定容至1L，溶液经高温高压灭菌后，于室温下保存；

5.2.410mmol/LTris-HCl（pH8.0）：称取Tris-HCl（5.1.9）1.21g溶解于约800ml超纯水（5.1.3）中，加浓盐酸（5.1.15）或氢氧化钠（5.1.16）调节溶液pH值至8.0，用超纯水（5.1.3）定容至1L，溶液经高温高压灭菌后，于室温下保存；

5.2.50.5mol/LEDTA（pH8.0）：称取EDTA.2Na·2H2O（5.1.10）186.1g溶解于约800ml超纯水（5.1.3）中，加氢氧化钠（5.1.16）调节溶液的pH值至8.0，用超纯水（5.1.3）定容至1L，溶液经高温高压灭

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菌后，于室温下保存；

5.2.61mmol/LEDTA（pH8.0）：称取EDTA.2Na·2H2O（5.1.10）0.37g溶解于约800ml超纯水（5.1.3）中，加氢氧化钠（5.1.16）调节溶液的pH值至8.0，用超纯水（5.1.3）定容至1L，溶液经高温高压灭菌后，于室温下保存；

5.2.7TE缓冲溶液(Tris-HCl、EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCl（5.2.4），1mmol/LEDTA（5.2.6）；

5.2.8CTAB提取缓冲液：CTAB（5.1.11）10g、NaCl（5.1.12）40.91g、1mol/LTris-HCl（5.2.3）50ml、0.5mol/LEDTA（5.2.5）20ml