中华鳖Sirtuin家族基因分析及SIRT1、SIRT4在性腺中的作用研究.pdfVIP

摘要

中华鳖是重要的经济水产品，在我国分布范围广深受消费者喜爱，中华鳖在生长过

程中具有明显性别二态性，性腺分化和性腺发育是研究重点。目前对于中华鳖性别分化

研究集中在性别相关基因，而表观遗传调控的研究很少。Sirtuin家族基因作为去乙酰化

酶的成员，参与哺乳动物生殖、性腺发育。本研究以中华鳖为研究对象，对Sirtuin家族

基因进行鉴定，qRT-PCR分析Sirtuin在不同组织及胚胎不同发育时期性腺中的表达模

式。克隆SIRT1和SIRT4的cDNA全长，通过敲低SIRT1和SIRT4研究在中华鳖性腺分

化中作用。利用SIRT1的特异性激动剂和抑制剂对稚鳖处理，探索SIRT1对中华鳖性腺

和心肝脾的影响，为中华鳖性腺分化和性腺发育提供基础数据和参考，实验结果如下：

（1）中华鳖Sirtuin家族基因的全基因组鉴定、进化和表达分析

鉴定了中华鳖Sirtuin家族基因，它们分布在不同scaffold，外显子的个数在3~13之

间，内含子个数在2~12之间，外显子和内含子数量有差异。蛋白序列保守结构域分析

显示都有SIR2结构域，保守基序分布上都具有Motif1、4、6，但是不同亚型也有其独

有的保守基序。中华鳖Sirtuin蛋白的分子质量在28.5~63kDa之间；等电点在4.65~9.38

之间；Sirtuin都是亲水性蛋白且都没有跨膜区和信号肽；SIRT1和SIRT2是酸性蛋白，

其他都为碱性蛋白。SIRT4是稳定性蛋白，其他成员为不稳定蛋白。预测中华鳖SIRT1、

SIRT6和SIRT7定位在细胞核中，SIRT3、SIRT4和SIRT5定位在线粒体中，SIRT2在

细胞质和细胞核中都有定位。中华鳖Sirtuin蛋白三级结构很相似，均由一个Rossman折

叠形成的大结构域和锌指结构构成的小结构域组成。系统进化显示Sirtuin在物种之间

高度保守，同时SIRT1、SIRT2和SIRT3聚在一起，SIRT6和SIRT7聚在一起。Sirtuin成

员在中华鳖性腺组织中都有表达，其中SIRT1和SIRT4在性腺组织中差异性高表达，在

胚胎发育不同时期，Sirtuin成员在性腺分化时期都表现出下降趋势，性腺分化结束后

Sirtuin在胚胎性腺表达规律出现差异。

（2）SIRT1和SIRT4基因克隆及氨基酸序列比对，SIRT1的多克隆抗体制备

采用RACE法克隆了中华鳖SIRT1和SIRT4cDNA全长。中华鳖SIRT1cDNA全

长2106bp，5′非编码区226bp,3′非编码区203bp，开放阅读框1677bp，编码558个氨

基酸。SIRT4cDNA全长1944bp，5′非编码区271bp,3′非编码区905bp，开放阅读框

768bp，编码255个氨基酸。分析SIRT1氨基酸序列的抗原表位，构建SIRT1重组表达

质粒，获得融合蛋白并使用实验小鼠进行免疫，成功制备了中华鳖SIRT1多克隆抗体。

5

Elisa法检测SIRT1效价为8.1×10，表明抗体可用于下一步的实验。

（3）SIRT1和SIRT4在中华鳖胚胎性腺发育中功能研究

敲低SIRT1和SIRT4后中华鳖胚胎性腺指数下降并且雌激素和雄激素含量下降，雌

性胚胎髓质区没有正常退化，空泡化程度低，雄性胚胎髓质区发育减缓，性索结构不完

整。雌性胚胎性腺中Cyp19a1、Foxl2、Rspo1、17β-HSD基因的表达量下降，雄性胚胎

性腺中Amh、Dmrt1、3β-HSD、STAR基因的表达量下降。

（4）SIRT1激动剂和抑制剂对稚鳖性腺和心肝脾的影响

抑制剂处理后稚鳖卵巢中GnRH、Fshb、p53、p65、Foxo3a、BCL2、Bax、mTOR和

rpS6的表达量上升；激动剂处理后GnRH、Fshb、p50、p65、的表达量下降，BCL2、Bax、

mTOR、rpS6基因的表达量上升。SIRT1的活性被干扰，原始卵泡数目减少。激动剂处理

后雄性稚鳖性腺髓质区发育更快，分枝状性索结构更多。SIRT1活性被干扰后稚鳖心肌

纤维排列疏松，高浓度激动剂和抑制剂处理后心肌纤维受到损伤。抑制剂处理后肝脏出

现炎症反应，中央静脉附近出现