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施万菌种水平的鉴定（MLSA法）
D.1核酸模板制备
按照8.6.1进行操作。
D.2PCR反应体系
管家基因的上下游引物见表D.1。PCR反应体系按照8.6.2进行操作。
表D.1施万菌PCR管家基因引物
管家扩增序列长度
引物名称序列（5→3）退火温度(°C)
基因(bp)
gyrA-164FTGAAGAACGATTGGAACAA
gyrA66456
gyrA-827RTTTTCAATCAAACGAGCTTT
UP-1GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA
gyrB125658
UP-2rAGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC
infB-1426FATGCCACAGACTATTGAAGC
infB83056
infB-2255RGCATCAGCACGAACGTTAAA
recN-415FAGTGAGCATCAACTGACC
recN86354
recN-1277RGGTTGTAAAGGTTGCCCTGGGTT
rpoA-83FTGGAGCCGCTTGAGCGTGGTTT
rpoA75156
rpoA-833RATGTAATGAATCGCTTCGGC
topA-70FGAATTCATCGTTAAGTCGAG
topA86060
topA-929RCGCTGGGCCATCATCATGGT
D.3PCR扩增条件
94°C预变性10min，然后94°C变性30s，54~60°C退火30s，72°C延伸60s，进行35个循
环，最后72°C延伸10min。对于上述6对管家基因，PCR扩增的退火温度见表D.1。
D.4扩增产物分析
PCR扩增结束后，取5μL产物于1%琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳45min，验证是否为单
一条带并位于相应的片段大小位置上。剩余产物使用相应管家基因引物进行双向测序。
D.5构建MLSA进化树
将测序获得的实验菌株gyrA、gyrB、infB、recN、rpoA和topA基因分别对应大肠杆菌56-1455、
247-744、337-1446、1519-2181、565-1200、139-756和106-768的基因位点截齐，然后将六个管家基
因序列按gyrA-gyrB-infB-recN-rpoA-topA顺序依次串联。并以施万菌种模式菌株相应管家基因序列作
为参考（见表D.2），参考序列的截齐与串联同实验菌株序列。汇总实验菌株与模式菌株六个基因的
串联序列，利用MEGA软件，对六基因串联序列进行邻接法（Neighbour-Joining）系统进化树构建，
替代模型选择Kimura两参数模型（Kimura’s2-parameter）；空
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