植物生物工程实验二植物DNA的提取.ppt

琼脂糖凝胶电泳取5×TBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL1×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。第37页,共42页，星期六，2024年，5月3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。第38页,共42页，星期六，2024年，5月加样：取10μLDNA样品与2μL6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。第39页,共42页，星期六，2024年，5月紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。b．分光光度计先用一定量的水校正零点。c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。d．计算浓度。双链DNA样品浓度(μg/μl)=OD260×核酸稀释倍数×50/1000；e．分析纯度。第40页,共42页，星期六，2024年，5月PCR反应体系成分体积DNA模板1ug前向引物(10uM)1ul后向引物(10uM)1ulMasterMix(Taq酶+缓冲液+染料)12.5ulddH2O补至25ul第41页,共42页，星期六，2024年，5月PCR反应程序温度时间循环9510min19430S356030S35721min35725min1第42页,共42页，星期六，2024年，5月基因组DNA的提取CTAB法SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法DNA提取的方法第5页,共42页，星期六，2024年，5月在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:

①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.

②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.

③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀第6页,共42页，星期六，2024年，5月CTAB法原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物高盐溶液中（0.7mol/LNaCl），该复合物可溶的有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB第7页,共42页，星期六，2024年，5月CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl