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二、γ-氨基丁酸的高效液相色谱测定法
本方法适用于保健食品中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid）的测定。
本方法γ-氨基丁酸的检出限为10ng。
1.方法提要
γ-氨基丁酸用异硫氰酸苯酯柱前衍生，衍生物采用氨基酸分析柱分离，二元流动相梯度洗脱，248nm波长下紫外检测器检测，以保留时间定性，以峰面积外标法定量。
2.仪器
（1）高效液相色谱仪，配紫外检测器。
（2）旋涡混合器
3.试剂
本方法除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
（1）乙腈：色谱纯。
（2）异硫氰酸苯酯乙腈溶液：吸取0.5mL异硫氰酸苯酯，加入40mL乙腈溶解。
（3）盐酸溶液（0.1mol/L）：取分析纯浓盐酸8.3mL，加水稀释至1L。
（4）三乙胺-乙腈溶液：15mL三乙胺与85mL乙腈混合而成。
（5）γ-氨基丁酸标准品：纯度99.9%，Sigma公司。
（6）γ-氨基丁酸标准溶液：精确称取γ-氨基丁酸10mg，置于10mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释到刻度，摇匀，得浓度为1mg/mL的标准储备溶液。将此标准储备液用0.1mol/L盐酸溶液稀释成浓度分别为10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的标准溶液系列。
（7）醋酸钠溶液：0.05mol/L，用作流动相A。
（8）乙腈-水溶液：乙腈-水（80+20），用作流动相B。
（9）正己烷。
4．测定步骤
（1）供试样品溶液的制备
1）提取：称取适量样品(相当于γ-氨基丁酸4mg，精密至0.001g)，置于100mL三角烧瓶中，加入盐酸溶液(0.1mol/L)适量，40℃超声提取20min，冷却，转移至100mL容量瓶，加盐酸溶液(0.1mol/L)至刻度，摇匀，静置，取适量过滤，得样品提取液。
2）衍生化：取样品提取液0.2mL，置于5mL具塞试管中，加异硫氰酸苯酯-乙腈溶液0.4mL，再加三乙胺-乙腈溶液1.4mL，摇匀，放置1小时，然后加入正己烷2mL，漩涡混合1min，静置，取下层液体作为待测溶液。
（2）标准工作液的储备：精密量取10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL的标准溶液0.2mL，分别置于5mL具塞试管中，同样品进行衍生后，得到浓度为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL的标准系列溶液，待上机测定。
（3）色谱条件
色谱柱：Venusil-AA氨基酸分析柱，250mmX4.6mm，5μm。
流动相：流动相A为0.05mol/L醋酸钠溶液，流动相B为乙腈-水溶液，采用梯度洗脱方式，时间程序见表3-11。
表3-11梯度洗脱时间程序
时间（min）
A（%）
B（%）
时间（min）
A（%）
B（%）
0
100
0
38
66
34
6
97
3
40
0
100
22
89
11
44
0
100
23
79
21
流速：1.0mL/min。
波长：248nm。
进样量：10μL。
柱温：室温。
（4）色谱测定：分别将10μL不同质量浓度的氨基丁酸标准工作溶液及制备后的样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以氨基丁酸质量浓度与相对应的峰面积绘制工作曲线，获得线性回归方程及相关系数，以此计算样品进样溶液中氨基丁酸的浓度。
5.结果计算
试样中γ-氨基丁酸的含量按下式进行计算：
X
式中X——样品中γ-氨基丁酸的含量（mg/g）；
C——样品进样溶液中氨基酸的的质量浓度（μg/mL）；
m——样品的取样量（g）；
图3-17γ-氨基丁酸
图3-17γ-氨基丁酸
结构式
10——样品衍生过程中的稀释倍数；
1000——由μg换算为mg的换算系数。
6．注释
γ-氨基丁酸分子式为C4H9NO2，分子量为103.1，分子结构式见图3-171。本文保健食品样品中γ-氨基丁酸含量为175mg/kg。在衍生化步骤中，加入正己烷的目的是除去脂溶性物质。
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