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DFRKN1碱性磷酸酶功能团的定量分析

摘要：本文研究以根结线虫天敌真菌1分离物为材料，提取纯化得到DFRKN1碱性磷酸酶，并采用化学修饰的方法对酶的必需功能团进行定性分析，确定色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基为酶的活性中心的必需功能团，在此基础上，对DFRKN1碱性磷酸酶的必需功能团进行定量研究。分别用不同浓度N溴代琥珀酰亚胺修饰酶蛋白的色氨酸残基，溴乙酸修饰酶蛋白的组氨酸残基的咪唑基，甲醛修饰酶蛋白的赖氨酸残基，测定酶活性计算反应速度常数，以反应速度常数的变动来确定必需基团的数目，实验结果表明：酶活性中心必需功能团色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基的数目均为一个。

根结线虫是植物根系内定居性寄生物，植物根结线虫病每年可以造成农作物经济损失超过700亿美元。根结线虫的寄主广泛，可以侵染的植物种类超过3000种，其中包括大部分的农作物，可造成农作物10%～20%的减产，严重的可以减产75%，甚至绝产。目前有报道的根结线虫种类可达90种以上，其中南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫是四种常见的根结线虫，造成的经济损失占整个根结线虫引起的作物损失的90%以上。随着城市周边大规模温棚蔬菜生产基地的不断扩大，连作的耕种方式、缺乏新品种引进检疫、防病措施不到位等造成根结线虫发生逐年增加。目前国内根结线虫的防控主要以化学防治为主，化学杀虫剂的使用可以使根结线虫产生抗药性，并且造成环境污染。因此，生物防治根结线虫是一种可持续发展、不污染环境的有效措施。而开发高效稳定的防生菌成为根结线虫防治的关键所在。张靠稳等［1］、马爱瑛等［2］从宁夏温室黄瓜根结线虫上分离得到一株天敌真菌，此分离物对根结线虫有较强的拮抗作用，该分离物能够从根结线虫的卵、二龄幼虫和成虫体表直接侵入，命名为根结线虫天敌真菌1号分离物（DFRKN1）。

碱性磷酸酶（E.C.3.1.3.1）是一类在碱性条件下具有较高催化活性，能催化几乎所有磷酸单酯水解生成正磷酸和对应酯、酚、糖等物质的一组特异性水解酶类，广泛存在于动物、植物及微生物体内，在生物体内有重要作用，直接参与生物体内磷代谢过程，维持体内合适的钙磷比例，是生物代谢过程中重要的调节酶。DFRKN1的碱性磷酸酶稳定性可以反映其代谢稳定性。本文在前期研究的基础上，通过对DFRKN1碱性磷酸酶的功能团的定量分析，以期进一步了解碱性磷酸酶的特性，为深入研究DFRKN1侵入线虫的机理及开发利用奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

根结线虫天敌真菌1号分离菌（DFRKN1）由北方民族大学张靠稳教授提供。

1.2主要试剂

2硫代2硝基苯甲酸（DTNB）、溴代乙酸（BrAc）、N溴代琥珀酰亚胺（NBS）、乙酰丙酮、苯甲基磺酰氟（PMSF）为Sigma公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3试验方法

1.3.1菌种的培养

将DFRKN1按2%接种到150mL的玉米粉液体培养基中，27℃摇床培养，100r/min，培养3～5天。

1.3.2碱性磷酸酶的分离与纯化

碱性磷酸酶的分离纯化参考文献进行［3］。

1.3.3酶活力的测定

碱性磷酸酶水解底物pNPP产生硝基苯酚（pNP）和无机磷酸（HPO42），硝基苯酚在405nm处有最大的吸收峰［4］。

酶活力（单位）=△A405×1000

1.3.4酶的必需基团的定性分析

采用DTNB（2硫代2硝基甲酸）、NBS（N溴代琥珀酰亚胺）、乙酰丙酮、PMSF（苯甲基磺酰氯）、BrAc（溴乙酸）、甲醛等化学修饰剂处理酶液。修饰后测定碱性磷酸酶的酶活。

1.3.5酶活性中心必需基团的定量分析

按夏初临等［5］采用的方法，对酶活性中心的必需基团进行定量分析。首先判断酶的修饰反应属于一级反应，以剩余酶活力的对数对修饰时间作图。然后测定修饰反应的一级速度常数，以反应速度常数的变动来推断必需基团的数目。在不同浓度的化学修饰剂下，测定酶失活的一级速度常数（k1），以对数作图法作lgk1与lg［I］的关系，从直线的斜率求必需基团的数目。

2结果与分析

2.1必需功能团的定性分析

DTNB在一定条件下能专一地修饰巯基，实验中当DTNB的浓度达到4mmol/L时，对酶活力基本没有影响，说明巯基不是酶活性中心必需的官能团。

用NBS修饰碱性磷酸酶时，酶剩余活力随NBS浓度增加而急剧下降，当NBS浓度达到0.4mmol/L时，酶活力仅剩11.40%（如图1所示），NBS在适宜条件下，能作用于巯基和色氨酸的吲哚基，从DTNB对酶的修饰结果可以得出巯基不是必需基团之一，所以NBS对酶的修饰作用说明了色氨酸是酶的活性中心的必需基团之一。

乙酰丙酮在碱性条件下能修饰精氨酸，从实验结果可以看出，乙酰丙酮的浓度在10～20mmol/L范围内时酶活力随浓度增大而降低；但当浓度达到40mmol/L以上时，酶活力基本