基因工程第三章克隆载体.ppt

*第二节病毒载体virusvector什么是病毒?病毒：由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。1/31噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期2/31天然的转基因过程1.λ噬菌体克隆载体*λ噬菌体（Bacteriophagelambda）头部尾部尾丝3/311.1、λ噬菌体的性质*4/31线状，双链DNA，48502bpλDNA：01cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。（linear，double-strandedDNA，dsDNA）02宿主细胞头部尾部尾丝λDNA5/316/31*（2）λDNA有56个限制酶识别序列，50个基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos头部合成尾部合成删除与结合重组DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂leftarm右臂rightarm中央片段centralstuffer7/31λ噬菌体的侵染*8/311.2、λ噬菌体载体的构建*（1）切去λDNA的中央片段BamHIsitesLeftarmRightarmCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/31插入标记基因（markergene）例如：lacZ基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色.10/31插入外源基因（foreigngene）可插入20kb的目的基因。111/312*部分消化DNAligase基因组DNACOSCOSLRAimgeneLRAimgeneCOS12/3120kb的DNA片段建立λDNA体外包装系统（packingsystem）包装后方可侵染.13/31重组的噬菌体体外包装14/31*2、柯斯质粒载体（Cosmidvector）2.1含义：含有λ噬菌体粘性末端（cos位点）的质粒，又称粘粒2.2特点：带有cos位点4-6kb有标记基因常用于构建cDNA文库（cDNAlibrary）可携带大的基因片段，45kb。2.3构建过程15/31体外包装16/31第三节、染色体定位整合载体*基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。117/312一、定位整合模式*GenomeDNAofreceptorcellVectorDNAVectorDNAHomologoussequence03GenomeDNAofreceptorcellForeignDNA0218/31Homologoussequence01010203与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低(10-7-10-3).会出现随机插入，筛选困难。定位整合效率19/31第四节YAC克隆载体*定义酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（cen4）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。可容纳1000至3000kb的DNA大片段。20/31是Yeast和E.coli.的穿梭载体(shuttlevector)YAC在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体21/31*着丝粒端粒自主复制序列22/31端粒E.coli.originofreplicationmarkergenesinyeastmarkergenesInE.coli.markergenesinyeastEcoRI0223/3103外源基因01YAC克隆载体的构建04*