蛋白质的裂解.ppt

1．原理。溴化氰（CNBr）裂解法是多种化学法中最重要的也是最常见的方法。。由Gross和Witkop于1962年建立的。后人进行了系统研究,能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到85%。由于蛋白质中的Met一般都比较少，因此裂解后的肽段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序（－）溴化氰裂解第30页，共47页，星期日，2025年，2月5日CNBr裂解蛋氨酸残基的反应机理：CNBr裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应第31页，共47页，星期日，2025年，2月5日在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应如：用70％甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧链暴露，有利于CNBr的裂解甲硫氨酸的氧化产物亚砜Met(SO)或砜Met(SO3)不能与CNBr反应为防止甲硫氨酸被氧化，整个反应应在氮气流或充氮容器中进行当甲硫氨酸在N末端，则产生游离的高丝氨酸内酯：第32页，共47页，星期日，2025年，2月5日当肽链中有二个相邻的甲硫氨酸，则产生一游离高丝氨酸内酯和二个新肽段：当甲硫氨酸在C末端，则C末端变为高丝氨酸内酯：第33页，共47页，星期日，2025年，2月5日第1页，共47页，星期日，2025年，2月5日用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用裂解条件要求：裂解点少专一性强反应产率高裂解方法：酶法化学法酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段一、引言早期：部分酸水解法裂解，由于专一性低，裂解后生成很多小肽，造成分离纯化困难，工作量也很大。中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专一性强，故被广泛地使用。后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对大肽段的需求，发现某些化学试剂对蛋白质的裂解有特异的优点。化学法再流行。第2页，共47页，星期日，2025年，2月5日（－）简述用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素：（1）合适的pH（2）适宜的反应温度（3）恰当的酶与底物的比率（4）选择相应的反应时间二、蛋白质的酶裂解第3页，共47页，星期日，2025年，2月5日第4页，共47页，星期日，2025年，2月5日最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段商品胰蛋白酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，这样，在酶解时会产生不希望有的肽片段。因此，使用前需用L-1（对-甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称TPCK）处理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用TPCK处理过的胰蛋白酶。1、胰蛋白酶第5页，共47页，星期日，2025年，2月5日讨论：如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大麻烦。方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。ε-氨基保护剂第6页，共47页，星期日，2025年，2月5日第7页，共47页，星期日，2025年，2月5日