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多胺氧化酶（PAO）活性检测试剂盒实验解决方案

原理

多胺氧化酶（Polyamineoxidase,PAO）是催化生物体内多胺氧化的关键酶，通过调节体内多胺水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。CheKine?多胺氧化酶（PAO）活性检测试剂盒（微量法）可检测动植物组织血清或血浆等生物样本。在该试剂盒中，PAO催化多胺氧化产生过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下与底物显色，在500nm下有特征吸收峰，通过测定吸光值增加速率来反映PAO活性。

自备耗材

·酶标仪或可见光分光光度计（能测500nm处的吸光度）

·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头、1.5mL离心管

·水浴锅、低温离心机

·去离子水

·匀浆器或研钵（如果是组织样本）

试剂准备

ReagentI：即用型；使用前，平衡到室温。4℃保存。

ReagentII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

ReagentIV：即用型；使用前，平衡到室温。4℃避光保存。

注意：ReagentII和ReagentIV有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。

样本制备

注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。测定时，应控制解冻的温度和时间。室温环境下解冻时，需在4h内完成样品解冻。

组织：称取约0.1g样本，加入1mLReagentI，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心20min，取上清液，置冰上待测。

血清（浆）等液体样本：直接检测。若有沉淀，离心后测定。

注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到500nm，可见光分光光度计用去离子水调零。

操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：

试剂

测定孔（μL）

样本

20

ReagentⅠ

140

ReagentⅡ

20

ReagentⅢ

10

ReagentⅣ

10

迅速混匀，记录500nm处吸光值A1和30min后吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5，样本可用ReagentⅠ进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。

PAO活性的计算

按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每毫克蛋白在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001定义为一个酶活力单位。

PAO(U/mgprot)=ΔA×V反总÷(V样×Cpr)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每克样本在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001定义为一个酶活力单位。

PAO(U/g鲜重)=ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.001÷T=333.33×ΔA÷W

按样本体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体在每mL反应体系中每分钟A500变化0.001为一个酶活力单位。

PAO(U/mL)=ΔA×V反总÷V样÷0.001÷T=333.33×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入的样本体积，0.02mL；V样总：提取时加入ReagentⅠ的体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min；W：样本质量，g。

结果展示

以下数据仅供参考，实验者需根据自己的实验对样品进行检测。

Figure1.本试剂盒测定小鼠肝脏和绿萝叶中PAO的活性

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CatalogNo.

ProductName

KTB1150

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