植物总dna提取及琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

植物总DNA的提取

及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)背景知识核酸的存在形式DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。030201核酸的理化性质基本过程细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸1机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；3酶解法：加入溶菌酶，破坏细胞壁。2化学试剂法：用SDS处理细胞；细胞破碎SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取RNA常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。DNA纯化（去杂质）2试剂32×CTAB抽提液1新鲜蔬菜叶片(去叶脉)5氯仿：异戊醇(24:1)4TE缓冲液(pH=8.0)实验材料材料与试剂①离心机②水浴锅③研钵④微量移液器仪器用具移液器－量程的选择取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。将1mL研磨液转入1.5mL离心管中，置于65℃水浴中保温20min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞12000r/min离心5min，取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心5min。抽提去蛋白将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600μL异丙醇。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于20μLTE缓冲液待测。操作步骤选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。321注意事项电泳原理DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2仪器和试剂仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等常用电泳缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。溴化乙锭（EB）EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。注意事项：0102核酸染色剂