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拟南芥钙依赖蛋白激酶单磷酸化位点突变双分子荧光互补载体的构建

摘要：将含有pGADT7-CPK4重组载体的E.coliDH5α菌液进行质粒提取,作为后续实验的基因模板。首先，要得到点突变的目的片段，主要是利用设计好的突变引物，通过三轮PCR反应获取。接着，将突变片段CPK4(N3)进行电泳和胶回收，对目的片段和双分子荧光互补实验空载体pSPYCE分别进行双酶切。之后，再用T4连接酶连接、转化，并将其涂布于含有卡那抗性的LB培养基中,过夜培养之后挑选阳性单克隆。最后，进行菌落PCR、酶切鉴定和测序。测

序结果表明：成功构建了拟南芥钙依赖蛋白激酶单磷酸化位点突变双分子荧光互补载体pSPYCE-CPK4(N3)。

关键词：载体构建；点突变；聚合酶链式反应;钙依赖蛋白激酶

0引言

蛋白激酶(proteinkinases,简称PK)包括蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白激酶G和钙调蛋白的蛋白激酶，其作用主要是催化蛋白质磷酸化[1]。磷酸根可以和羟基发生结合，而达到蛋白质或者酶构相象和活性发生改变的效果[2]。Ca2+是植物中重要的第二信使，在植物的新陈代谢和生长发育过程中都发挥着重要的作用[11]。钙依赖型蛋白激酶（CDPK）是钙调蛋白类的蛋白激酶中的一种，是植物中特有的蛋白激酶家族，其很多成员都参与在植物抵御非生物逆境和抗病虫害等生理功能中。CDPK的表达改变可被部分植物激素，例如生长素(IAA)和脱落酸（ABA）等诱导。虽然钙依赖蛋白激酶的功能研究已经比较多了，但其中分子机理的研究大多还不够深入，本课题将在前人研究的基础上进一步探讨CDPK的磷酸化修饰对其分子、生化功能的影响。

材料与方法

实验材料

菌株与载体

含有pGADT7-CPK4重组质粒的E.coli（Escherichiacoli）DH5α、设计好用于引入点突变的CPK4引物、大肠杆菌DH5α感受态、空载体pSPYCE。

实验仪器及用具

冷冻冰箱、高压灭菌锅、离心机、紫外分光光度计、摇床、培养皿、漩涡震荡仪、PCR仪、电子天平、恒温培养箱、试管、水浴锅、离心机、微量移液枪、PE管、微波炉、烧杯、量筒、锥形瓶、试管架、酒精灯、金属涂布棒、紫外照胶仪、比色皿等。

工具酶、试剂盒与生化试剂

小量质粒小提试剂盒:OMEGAPlasmidMiniKitI、胶回收试剂盒:MOEGAGelExtractionKit、限制性核酸内

切酶BamHI与SalI、T4DNA连接酶：T4DNALigase、Gelred核酸染料、1×TAE缓冲液、卡那青霉素Kana(在-20℃保存)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、氯化钠等。

PCR引物：如表1所示。

表1基因克隆与表达分析引物序列

Name

Primer（5’-3’）

CP-N3(F)

CAGACTTTGGTTTGGATGTCTTCTACAAGCC

CP-N3(R)

GGCTTGTAGAAGACATCCAAACCAAAGTCTG

CP-YC(F)

CGCGGATCCATGGAGAAACCAAACCCTAG

CP-YC(R)

GCGCGTCGACCTTTGGTGAATCATCAGATTTAG

常用培养基和溶液的配制

表2LB液体培养基单位(g)

体积

1000ml

胰蛋白胨

10

酵母提取物

5

NacL

10

表3LB固体培养基单位(g)

体积

1000ml

胰蛋白胨

10

酵母提取物

5

NacL

10

琼脂粉

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实验过程与方法

质粒的提取

在抗性LB培养基接种带有质粒的E.coli，在摇床上培养15h左右，温度条件为37℃。

用移液枪吸取2ml经培养过的菌液，10000rpm离心一分钟，得到细菌；

吸取250μl试剂盒中的Solution1混合液缓慢加入，要注意加入后使离心后黏附在管底和管壁上的细胞与混合液充分混合；

同理加入Solution2，混合条件变为缓慢颠倒，次数约为5次，反应时间为5min以内。

加入350μlSolution3，直到形成白色絮状沉淀之后停止混匀，注意动作要缓慢。

将离心机转速调到13000rpm，把离心管放入其中离心10分钟。

在离心时准备好HiBind?MiniprepDNA结合柱，柱外套有大小为2ml的收集管，将上清液转入柱中，

13000rpm离心1min,弃滤液。

套回柱子，取500μlHBCBuffer于其中,13000xg离心1min，倒掉滤液。

将柱子装回管中，加700μlDNAWashBuffer于其中,13000xg离心1min,弃滤液。

组装好柱子和收集管最大速度空甩两分钟。

将空甩后的柱子与1.5ml的离心管组装，对准柱悬空加入50μlElutionBuffer，枪头不要碰到结合住的内壁，静置60s，1