海城市宠物犬沙门氏菌携带情况调查与耐药性分析 .pdf

糊J氏菌岫新瞬查与而搦

盼析

沙门氏菌是杆状的革兰氏阴性兼性厌氧菌，属于肠杆菌科，是一种非常重要

的人畜共患病。目前，国内外已有大量关于人源、鸡源、猪源、食源、沙门氏

菌耐药性的研究，宠物犬源沙门氏菌耐药情况国内鲜有报道。目前，我国宠物数

量不断增加，人与宠物之间的依赖关系也日益凸显。宠物行业的快速发展，愈来

愈多的兽用甚至是人用抗生素被用于宠物病的预防和治疗。然而，随着抗生素

的广泛应用，沙门氏菌的耐药性也愈来愈严重，这不仅影响临床治疗效果，而且

由于人与宠物的密切接触，增加了耐药细菌传给人类的风险。本研究采用PCR

技术对海城市宠物犬肛门棉拭子进行分离鉴定，并确定分离株的血清型；

Kirby-Bauer纸片扩散法（K-B）测定宠物犬源沙门氏菌分离株对临床常用药物的

敏感性，并测定blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR、tetA和tetC基因，了解锦

州地区宠物犬携带沙门氏菌的情况，并从基因水平结合表现耐药进行药物敏感性

分析，为锦州地区宠物犬临床用药提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源犬源沙门氏菌，采自辽宁省海城市宠物门诊宠物犬肛门棉拭

子。

1.1.2主要培养基和试剂缓冲蛋白豚水（BPW）、普通琼脂培养基均购自

青岛海博生物技术有限公司。NA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

药敏纸片购于上海化科实验器材有限公司。引物序列由生工生物工程（上海）股

份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1样本的采集2018年5~12月，于海城市6家宠物医院随机共采集

健康犬82份和患病犬209份，总291份犬肛棉拭子样品。

1.2.2细菌分离、鉴定无菌操作把肛门棉拭子放入到5LBPW增菌液中

37°C,培养18h。轻轻摇动培养过的样品混合物使其均匀，移取1mL,转种于

WmLTTB内，于42°C±1°C培养18〜24h。取过夜培养的菌液，按照NA提

取试剂盒说明提取细菌组总NA作为模版。参照文献［1］合成沙门氏菌引物，

invA（5,一3，）:F:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA,R:

TCATCGCACCGTCAAAGGAACC,片段长度为285pb。

PCR反应体系为25|jL：BufferMix12.5|jL,dNTPs5pL,上下游引物各

1|JL,ddH2O调整总体积25pLoPCR反应条件为：95°C预变性5min；94°C

变性30s,60°C退火30s,72°C延伸30s,共35个循环；72°C延伸10min。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.3血清型鉴定依文献合成我国报道的主要沙门氏菌血清型（O抗原中B、

C1、和E1及鞭毛H抗原H1相和H2相）引物，O抗原（5-3‘）：B群：

F:GCGATTAGAGCATGTATATGGR:CAGTTCCAACTTGATACTCAGT,片段

大小为216pb；C1群:F：GACATGACTTTGAAATCGGGTA；R:ATTCCTACAC

GCACTAATACTG,片段大小为760pb；群：

F:GGTAAACTTATCGTCTCCATCA；R:CTTAGCAAGGAAGAGGAACAAT,

片段长度为385pb;E群:F:CTTTGCTGAGCTAGGTATAAGTA,

R:GCTATTCAAAGACGCTGTATATC,片段长度为1323pb。H抗原（5-3‘）：

H1相：F:TGACCCAGAATAACCTGAAC,R:TAACGCAGTAAAGAGAGGAC,

片段长度为1450pb；H2相：F:ATGGCACAAGTAATCAACAC,R:TAGTCG

GAATCTTCGATACG,片段大小1409pb。

PCR反应体系为25|jL,各组分如下BufferMix12.5|jL,dNTPs5|jL,上

下游引物各1IJL,ddH2O5.5ijLoPCR反应条件：扩增循环参数为：95°C预

变性5min；94°C变性30s,60°C退火30s,72°C延