蛋白质分离纯化.ppt

************************************************蛋白质分子量的测定渗透压法M=CRT/π第55页，共81页，星期日，2025年，2月5日蛋白质分子量的测定超离心法沉降平衡法：样品溶液在分析池中经低速长时间离心，分析池内样品浓度分布达到热力学平衡时，根据分析池内样品的浓度分布可以求算分子量。第56页，共81页，星期日，2025年，2月5日蛋白质分子量的测定凝胶过滤法经验公式：lgM=K1-K2Ve（K1、K2为常数）用几种已知蛋白质，测其Ve，再对lgM作图得标准曲线。再测定未知蛋白质的Ve，可得M。第57页，共81页，星期日，2025年，2月5日蛋白质分子量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳lgM=K1—K2μR（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）第58页，共81页，星期日，2025年，2月5日氨基酸平均分子量为128，测得某蛋白质分子量约为5646.由此推断该蛋白质含有的肽链条数和氨基酸个数依次是？氨基酸脱水缩合形成肽链，再形成蛋白质。每两个氨基酸脱掉一个水分子（就像5个手指头，有4个手指缝一样），倘若一个肽链，则有X个氨基酸，就会脱掉（X-1）个水；若两个肽链，则有X个氨基酸，就会脱掉（X-2）个水。。。依此类推假设：氨基酸个数为X个，肽链有y条，则，脱掉水分子个数为（X-y）个列式：128x-18（x-y）=5646110x+18y=5646110x=5646-18y因为肽链个数都有限，所以，y的数字从1开始试着带进去，看什么时候，x能得到整数解（因为无论氨基酸还是水都不可能是小数个）例如：当y=1时，x=51.16,现实中不可能，所以，结果排出再试着带入y=2时，x=51，整数解，符合实际情况，所以，答案应为2和51第59页，共81页，星期日，2025年，2月5日测定步骤1多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。2测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。3二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。第60页，共81页，星期日，2025年，2月5日4测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时，色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时，色氨酸在水解中不受破坏，其它氨基酸都受到不同程度的破坏。5分析多肽链的N-末端和C-末端N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；氨肽酶法），C末端分析法（肼解法；羧肽酶法；硼氢化锂法）。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。氨肽酶：能催化多肽链的游离N端（氨基末端），由外向里，把肽链的氨基酸逐个切下。较常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。特殊的氨肽酶有仅作用于N末端为脯氨酸的脯氨酸亚氨肽酶以及只作用于三肽的氨基三肽酶等。第61页，共81页，星期日，2025年，2月5日Sanger法N末端分析第62页，共81页，星期日，2025年，2月5日Edman降解法第63页，共81页，星期日，2025年，2月5日DNS-Cl法第64页，共81页，星期日，2025年，2月5日C末端分析肼解法：测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。羧肽酶A可以切割C端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸，羧肽酶B可以切割C端的Lys或Arg，但如果倒数第二个氨基酸为Pro两种羧肽酶均不能作用。第65页，共81页，星期日，2025年，2月5日6多肽链断裂成多个肽段。采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂