酶联免疫分析法.ppt

吖啶酯类化合物作为化学发光标记物有显著的优点：①氧化反应不需催化剂，只需要在碱性环境中就可以进行，发光反应快速，在1s内光子散射达到高峰，整个过程在2s内完成，可充分计数，背景噪声低。②这类化合物与被标记物的结合发生在分子一定部位，在氧化反应过程中，结合物被分解，吖啶酯分子从发光的部分断裂并分离下来，所以吖啶酯的发光不受抑制，敏感度不受标记反应的影响，试剂稳定性好。第62页，共85页，星期日，2025年，2月5日（2）氨基苯二酰肼类化合物鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）、异鲁米诺（6-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基异鲁米诺（ABEI）、氨己基乙基异鲁米诺（AHEI）、氨丁基乙基鲁米诺（ABENH）等均属于这一类化学发光剂。鲁米诺类化合物的发光反应必须有催化剂（如过氧化物酶）催化，且与蛋白或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类化合物在CLIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。第63页，共85页，星期日，2025年，2月5日鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式第64页，共85页，星期日，2025年，2月5日戊二醛一步法反应原理①一步法将戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。该法操作简便、有效，重复性好。缺点是交联反应是随机的，酶与酶、抗体与抗体之间有可能交联。第30页，共85页，星期日，2025年，2月5日戊二醛二步法反应原理②两步法先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体；或先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，有助于本底的改善。第31页，共85页，星期日，2025年，2月5日（2）过碘酸盐氧化法本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶（HRP）的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。第32页，共85页，星期日，2025年，2月5日2、ELISA试验方法三个必要试剂：①固相抗原或抗体；②酶标记抗原或抗体；③酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。如双抗体夹心法、间接法、竞争法、异种动物抗体双夹心法、抗酶抗体法、竞争性抑制法、双夹心法和抗原直接包被法等方法。第33页，共85页，星期日，2025年，2月5日（1）双抗体夹心法双抗体夹心法（doubleantibodysandwich，DAS-ELISA）由Clark和Adams于1977年建立，是最经典的ELISA检测法。该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强，成本较高。该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。第34页，共85页，星期日，2025年，2月5日双抗体夹心法第35页，共85页，星期日，2025年，2月5日（2）间接法（indirectELISA）是最常用的ELISA检测方法，其原理是利用酶标记的抗体和已与固相抗原结合的受检抗体相结合。该法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。该方法不必为每个待测抗体（或抗原）制备特异性的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化了实验。第36页，共85页，星期日，2025年，2月5日间接ELISA法第37页，共85页，星期日，2025年，2月5日（3）竞争法（competingELISA）利用待测抗原和酶标抗原与特异性抗体竞争结合；或待测抗体和酶标抗体与特异性抗原竞争结合而进行测定的一种方法。第38页，共85页，星期日，2025年，2月5日竞争ELISA法第39页，共85页，星期日，2025年，2月5日（4）异种动物抗体双夹心法又称间接双抗体夹心法（indirectDAS-ELISA）或三抗体夹心法（tripleantibodiessandwich，TAS-ELISA）。此法可用通用的酶标记抗体检验多种病毒，它不仅免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。第40页，共85页，星期日，2025年，2月5日异种动物抗体夹心法第41页，共85页，星期日，2025年，2月5日（5）抗酶抗体法抗酶抗体法是利用免疫学反应而不是用化学交联反应来制备酶结合物，常用HRP为标记酶作为抗原免疫动物制备抗HRP抗体。可用一种动物（如兔）制备特异性抗体（第一抗体）和抗酶抗体（第三抗体），再用另一种动物（如羊）制备抗第一种动物（兔）IgG的抗体（