细胞工程基本技术.pptVIP

真菌的污染检测与控制常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。可用抗真菌剂防止真菌污染。支原体的污染检测与控制支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过支原体培养、PCR及电镜观察等方法进行检测。支原体的去除可采用：41?°C0102病毒的污染检测与控制01病毒的污染主要是通过DNA的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。02对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及PCR法。0301细胞交叉污染及检测02在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。03有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。01培养操作前的准备(超净工作台的严格护理)02培养操作时的注意事项03其他注意事项（三）污染的预防无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要求）01在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠。0201要充分做好培养前的实验用品准备工作，根据研究内容的要求进行物品清点包装，注明标签后灭菌、烤干备用。在工作前移入超净工作台内。（一）培养前的准备02工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌，用30W紫外线灯管直接照射20—30分钟。然后关闭紫外灯，打开风机。超净工作台要用75％酒精擦拭。培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入。（二）培养室和超净工作台的消毒23%Option1（三）洗手和着装（四）无菌培养操作在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（火焰消毒）。原则上与外科手术洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水冲洗，然后用0.2％新洁尔灭或75％洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。30%Option2注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。010302为拿取方便，工作台面上的布局要合理，原则上为右手使用方便的用品放在右侧，左手用品在左侧。培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。0102各种显微镜技术同细胞生物学要掌握原理与应用八、显微技术九、细胞观察与分析细胞在培养过程中，要及时观察和了解生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各种状态的时间参数、细胞数量、分布位置等指标，以及体外因素对这些指标的调节机制。这属于细胞动力学的研究。广义的细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原理的研究。细胞计数法细胞生长曲线用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细胞浓度之间关系的曲线。以时间（横坐标）对细胞浓度（细胞数/ml为纵坐标）绘制，反映培养过程中细胞生长与死亡的动态变化。（一）细胞技术与活力分析在一群细胞中，进入分裂期细胞所占该群细胞的百分率，即为有丝分裂指数。它反映了细胞增殖的速度。分裂细胞数分裂指数=×100%细胞总数3、有丝分裂指数的测定14、细胞贴壁率又称接种存活率，贴壁附着生长的细胞状况直接反映细胞的生存能力。2流式细胞仪检测细胞周期细胞周期各时相控制并按一定的时间顺序予以表达的，而细胞周期各时相的分析，特别是细胞周期及其各时相时长的测定对于研究细胞群体的生长行为，尤其是对于包括DNA复制、细胞分裂在内的细胞增殖调节控制的研究，无疑是一个很重要的前提。基本步骤基本步骤细胞培养消化细胞计数种植60mm培养皿（70X104个细胞/皿）药物处理细胞收细胞（胰蛋白酶消化----培养基终止）2000转/分离心10min去上清液PBS重悬，重复6的步骤去上清加入100ul1mg/mlPI和100ul1