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中文摘要

基于IDC策略小型化Cas13蛋白的开发和应用

CRISPR/Cas系统作为一种革命性的基因编辑技术，已经广泛应用于基础研

究、基因治疗、核酸检测、诊断、成像和抗病毒等方面。CRISPR/Cas13系统是

RNA介导的靶向单链RNA（ssRNA）的核酸酶，其具有pre-crRNA加工活性和

RNA靶向活性。Cas13蛋白的大小普遍在950AA-1300AA之间，相对较大。然

而，由于腺相关病毒（AAV）的体内递送限制，开发用于基因治疗的

CRISPR/Cas编辑系统仍然具有挑战性。因此，紧凑型Cas蛋白酶的开发迫在眉

睫。

目前，相关研究已经提出了几种用于Cas蛋白小型化的成功策略。主要包

括：1）在宏基因组数据集中开发天然紧凑的Cas蛋白酶。然而，这些紧凑的

Cas蛋白并不完全具有先前优化的Cas蛋白的优势。2）通过修改Cas酶的功能，

去除不需要的功能结构域。但在这种策略中，Cas蛋白的DNA/RNA切割活性

通常被消除，仅仅保留DNA/RNA结合活性。3）通过生成随机缺失突变体库来

呈现SpCas9的整体缺失，使得突变体分别仅保留约72%和63%的SpCas9蛋白

序列，DNA结合和切割活性相应下降。4）通过构建Cas13d直系同源物中保守

性差的表面定位缺失变体，以最小的效率损失减小了蛋白大小，但该过程在很

大程度上受到可用片段的限制，无法满足Cas蛋白未来应用的小型化要求。由

于蛋白小型化存在以上的问题，因此，需要开发新的用于基因治疗的小型化策

略。

基于以上问题，本研究旨在开发新的小型化策略以开发紧凑型的Cas蛋白，

并利用小型化的Cas13蛋白构建相应的RNA编辑系统和进行基因治疗。

首先，我们提出了一种基于蛋白质结构和AlphaFld2的蛋白质小型化策略

——IDC策略，其目的是最大限度地使蛋白质小型化，同时保留蛋白质功能。

IDC策略是通过分析蛋白结构中蛋白-核酸相互作用、构象动力学和蛋白家族保

守性而建立的。I代表interaction。Cas13蛋白在行使功能时，要经历从单一蛋

白到与crRNA结合形成二元复合物，再与target-RNA结合形成三元复合物的过

程。在Cas13的整个功能发挥过程就主要围绕着RNA进行。因此，在蛋白结构

上，与RNA发生相互作用的结合位点以及支撑结合位点的支架结构单元是至关

重要的。D代表Dynamic。在Cas13蛋白功能行使过程中，各个功能结构域有

不同程度的变构活动。所以还要分析在变构过程中各个结合位点和支架结构单

元的变化。我们通过分析动态过程中的结合位点和支架结构单元，就能够对整

个蛋白的结构进行排除式地删除，以此生成紧凑型的Cas13d蛋白。C代表

Conservation。Cas13蛋白家族具有高度的结构保守性，因此以上“I”和“D”

的分析可以应用于结构保守性高的蛋白家族。所以将以上的三个分析过程

Interaction，Dynamic以及Conservation进行提炼，提出了蛋白小型化策略-

IDC策略。

其次，基于IDC策略和AlphaFold2预测结构，成功生成了三种紧凑型的

Cas13d变体。三种mini-Cas13d变体具有完全的RNA结合和切割活性，在

293T细胞中具有一致的敲低效率。此外，我们系统性的探究了mini-RfxCas13d

的体内外功能活性。结果发现mini-RfxCas13d的活性功能不仅与RfxCas13d基

本一致，且相较于RfxCas13d具有高保真活性，其脱靶率显著降低。随后，为

了扩大IDC策略的应用范围，我们针对两种应用广泛的Cas13b蛋白生成了

mini-Cas13b变体。两种mini-Cas13b变体保留了与野生型蛋白酶一致的酶活性。

最后，为了验证mini-Cas13蛋白是否能够应用于RNA碱基编辑和基因治疗。

我们将mini-RfxCas13d蛋白与ADAR2的脱氨酶结构域融合构建了一个RNA碱

基编辑器mini-Vx，其具有与Vx一致的A-I的编辑能力，并且基本不会引起转

录组中广泛的碱基突变。最后，通过将mini-RfxCas13d