鉴别布鲁氏菌野毒感染抗体与cVLPs疫苗免疫抗体的ic-ELISA方法的建立及初步应用.pdf

本课题由吉林省科技厅重点研发项目

《布鲁菌BCSP31蛋白嵌合病毒样颗粒疫苗的研发及应用》

（20200402037NC）资助

中文摘要

鉴别布鲁氏菌野毒感染抗体与cVLPs疫苗免疫抗体的

ic-ELISA方法的建立及初步应用

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由革兰氏阴性且胞内寄生的布鲁氏

菌（Brucella）而引起的一种严重危害的传染病。感染布鲁氏菌后，人往往表现

为流感样症状，常因误诊而错过救治时机；动物常表现为不孕不育，甚至影响

生殖能力，给养殖户造成严重的经济损失。为了人类健康以及畜牧业的持续发

展，必须重视布病的防控工作，研发绿色、高效的疫苗，建立规范的诊断方法，

以期保障动物和人类健康。

本团队前期已经成功构建了布鲁氏菌嵌合病毒样颗粒新型疫苗（cVLPs-

GPI-BCSP31），cVLPs-GPI-BCSP31能够高效激活小鼠树突状细胞，同时刺激小

鼠机体产生强烈的免疫应答反应，并能发挥与布鲁氏菌疫苗M5株相当的保护

作用，但缺乏与之匹配的鉴别布鲁氏菌野毒感染抗体和cVLPs-GPI-BCSP31疫

苗免疫抗体的检测方法，限制了cVLPs-GPI-BCSP31的应用及布鲁氏菌种群净

化。现阶段已知布病检测方法有许多种，如细菌学检测、血清学检测如凝集试

验（STA、RBPT、CFT）、ELISA试验、分子生物学试验等。其中ELISA方法

具有操作简便、敏感性高和特异性强等优点已逐渐成为布病检测的重要手段。

OMP28蛋白存在于布鲁氏菌的所有菌株中，具有良好的免疫原性，并且OMP28

蛋白可以从细胞内释放到细胞外，比其他组的外膜蛋白更容易被检测到，检出

率和准确率较高，是作为布病诊断的首选抗原蛋白。

因此，本文主要研究针对cVLPs-GPI-BCSP31不含有、但在布鲁氏菌所有

菌株中高表达的诊断性抗原OMP28为靶点，开发鉴别布鲁氏菌野毒感染抗体与

cVLPs-GPI-BCSP31疫苗免疫抗体的ic-ELISA方法（IndirectCompetitive

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ic-ELISA），并对其参数进行优化，评估

检测方法的重复性和特异性，并进行初步应用。主要研究内容如下：

1.OMP28兔多克隆抗体的制备及鉴定

扩增NCBI公布的BrucellamelitensisOMP28（GenBank：JF918758.1）序列,

将其插入到pET28a（+）表达载体中，构建重组表达质粒pET28a-OMP28；再

转化至DE3感受态细胞，加入IPTG诱导OMP28蛋白的表达；经Ni-NTAResin

纯化、复性后，采用SDS、Western-blot鉴定及BCA试剂盒测定蛋白浓

度；将OMP28蛋白以1.0mg/只的剂量免疫新西兰大白兔，首免后2周进行加强

免疫。间接ELISA（IndirectEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay，iELISA）方

法结果显示制备的兔多克隆抗体效价达到1:256000，抗体效价水平较高；

Westernblot鉴定结果显示兔多克隆抗体稀释1:2500后能与OMP28蛋白特异性

结合，无非特异性结合条带，表明OMP28兔多克隆抗体成功制备且特异性良好。

2.ic-ELISA方法的建立、优化及初步应用

以纯化的OMP28蛋白作为包被抗原，布鲁氏菌血清样本和OMP28兔多克

隆抗体为一抗建立ic-ELISA方法。对抗原的包被浓度及多克隆抗体的稀释比例、

封闭液种类及浓度、显色时间等参数进行优化，最终确定ic-ELISA方法最佳工

作条件为：抗原包被浓度为0.0625μg/孔、兔多克隆抗体稀释比例为1:8000、

封闭液种类为2%脱脂奶粉、封闭时间为1h、布鲁氏菌血清样本稀释比例为

1:20、酶标二抗稀释比例为1:3000、酶标二抗孵育时间为45min、TMB显色

时间为10min。通过特异性、重复性及符合