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本研究由：“国家自然科学基金联合基金资助项目(U19A2038)”资助

ThisworkwassupportedbyJointfundofNationalNaturalScience

FoundationofChina(U19A2038)

中文摘要

鲎素对产气荚膜梭菌前噬菌体的激活及其与噬菌体的联合作用

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens,Cp)是一种厌氧的革兰阳性条件致病菌，广泛分

布于土壤、食物、粪便及人畜肠道中。根据产气荚膜梭菌产生毒素的不同可分为七种类型

(A-G)，在临床上可引起多种动物的腹泻、气性坏疽、坏死性肠炎等。

噬菌体是一种能特异性感染细菌的病毒，以其独特的杀菌机制可以裂解细菌且不易产

生耐药性。面对噬菌体的攻击，细菌也进化出了多种复杂的防御策略，因此可以采用噬菌

体鸡尾酒或噬菌体与其他抗菌制剂联合使用的方式来进行临床治疗，以减少抗性菌的产生。

课题组前期通过基因工程重组表达了鲎素抗菌肽。在对腹泻仔猪治疗过程中发现低剂

量鲎素抗菌肽即可使因产气荚膜梭菌感染的腹泻仔猪恢复健康，增加其肠道菌群丰富度和

多样性。在体外2.5μg/mL的鲎素抗菌肽即可对产气荚膜梭菌产生杀伤作用。为对这种低剂

量杀伤现象进行更全面的介绍，便对鲎素抗菌肽作用后产气荚膜梭菌进行转录组数据分析，

结果发现鲎素抗菌肽对产气荚膜梭菌不仅有直接杀伤作用，还可以调节产气荚膜梭菌中多

种基因的转录水平。

本研究首先将鲎素抗菌肽对产气荚膜梭菌作用后的转录组数据进行分析和验证。差异

基因主要归属为致病性相关基因、代谢类相关基因及前噬菌体相关基因。荧光定量法验证

差异基因，并通过表观现象及细菌与IPEC-J2细胞相互作用进行进一步验证。实验发现鲎

素抗菌肽可以使产气荚膜梭菌毒力基因及能量代谢类相关基因表达量降低，糖代谢类相关

基因表达量升高、前噬菌体相关基因表达量升高。电镜下观察2.5μg/mL的鲎素抗菌肽对

产气荚膜梭菌作用2h，菌体周围出现粘液；作用4h后，菌体表面菌毛脱落，细胞膜开始

破裂；作用5h后细胞内容物开始外渗；作用6h后，菌体周围出现噬菌体样颗粒。细胞毒

性及粘附实验进一步证实鲎素抗菌肽可以降低产气荚膜梭菌的毒力及粘附性。在细胞毒性

实验中，鲎素抗菌肽作用组细胞存活率上升，与对照组形成显著差异。在细胞粘附实验

中，对照组粘附率为67.18±3.69%，而鲎素抗菌肽作用组的粘附率降低至25.6±5.22%。

DNA阻滞实验表明鲎素抗菌肽不与细菌DNA结合，其作用靶点不是细菌DNA。

鲎素抗菌肽对产气荚膜梭菌前噬菌体激活机制研究中，用丝裂霉素C诱导获得产气荚

膜梭菌溶原性噬菌体，命名为P14和P24，并通过纯化富集在电镜下观察到噬菌体颗粒。

荧光定量发现鲎素与丝裂霉素C都可使与激活前噬菌体表达相关基因的表达量升高。且溶

原性噬菌体、丝裂霉素C和鲎素抗菌肽都可使产气荚膜梭菌前噬菌体相关基因的表达量升

高。这表明鲎素抗菌肽可以作为激活剂促进前噬菌体的表达。用溶原性噬菌体与鲎素抗菌

肽联合作用发现，抗菌物质加入时序的不同会产生不同的杀菌效果。将溶原性噬菌体与鲎

素抗菌肽混合加入，没有产生协同作用。但用5μg/mL鲎素抗菌肽进行预处理后，再加入

溶原性噬菌体可以增强杀菌效果。结合以上现象及转录组数据进一步验证杀伤作用的增强

是由完整溶原性噬菌体颗粒的协同还是噬菌体蛋白的协同。于是进一步纯化表达了转录组

数据中高表达的Holin-A、Holin-B和尾蛋白。活性验证发现Holin蛋白直接作用杀菌活性

低，但可以抑制产气荚膜梭菌的生长，尾蛋白没有杀菌活性但具有靶向性。用重组Holin

蛋白及尾蛋白代替溶原性噬菌体进行以上实验发现没有产生协同作用。这表明要对产气荚

膜梭菌产生明显的杀伤效果，仅有Holin蛋白是不够的，需要噬菌体中多种蛋白的相互协

同。

从污水中分离获得2株烈性噬菌体，vB_CPP_AT和vB_CPP_X44，进一步验证噬菌体

与鲎素抗菌肽之间的联合作用。将烈性噬菌体与鲎素抗菌肽混合后作用于产气荚膜梭菌，

无协同效果，且铺板后没有发现噬菌斑的存在，这说明鲎素抗菌肽破坏了噬菌体对细菌的

裂解作用。用鲎素抗菌肽对产气荚膜梭菌进行预处理后再加入烈性噬菌体，其杀菌效果要

优于单独使用鲎素抗菌肽。该组合在30min内，可