表达产物的分离纯化.pptVIP

logo常用的离子交换剂1）离子交换树脂常见的是含酸性或碱性基团、人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物。优点：流速快，对小分子物质的交换容量大，适于氨基酸、核苷酸等小分子物质的纯化。2）离子交换纤维素是携带功能基团的纤维素衍生物，有松散的亲水性网状结构和较大表面积，大分子可自由通过，对蛋白质等生物大分子的交换容量比离子交换树脂大。阳离子型：羟甲基纤维素(CM纤维素)；阴离子型：二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的、具有多孔三维空间网状结构、离子交换功能基团的多糖衍生物。离子交换葡聚糖电离基团在母体上取代程度高、交换容量大、装柱方便、流速快。添加标题既有离子交换作用，又有分子筛效应。添加标题亲水性强，不会引起生物分子的变性、失活，母链对蛋白质、核酸等的非特异性吸附小。添加标题优点：添加标题常用的离子交换葡聚糖：C后面的数字=凝胶吸水量?10C-25：表示1g干燥的凝胶可吸水2.5mlDEAE-SephadexA-25Q-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50Q-SephadexA-50CM-SephadexC-25SPSephadexC-25CM-SephadexC-50SPSephadexC-50阳离子型：阴离子型：4）离子交换琼脂糖CM-Sepharose是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6B，具有硬度大、性质稳定、流速好、分离能力强等优点，受pH和离子强度影响引起的膨胀和收缩效应小，外形和体积稳定。DEAE-Sepharose阴离子型：阳离子型：两性电解质（如氨基酸、核苷酸、蛋白质）：根据其pI值及离子化曲线来选择。3124离子交换介质的选择原则碱性物质：用阳离子交换剂分离。酸性物质：用阴离子交换剂分离。12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pHpI（+）pH=pI（0）pHpI（-）对pI=5的某蛋白质：在pH5.5-9.0范围内，蛋白质为阴离子，首选DEAE纤维素。在pH3.5-4.5范围内，蛋白质为阳离子，首选CM纤维素。0102030405层析柱平衡单击此处添加小标题平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。单击此处添加小标题平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍；单击此处添加小标题离子交换层析的基本操作单击此处添加小标题平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速；单击此处添加小标题样品进柱交换容量：离子交换剂中可交换的离子或功能基团的总数。为达满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%。为避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高。样品洗脱恒定洗脱梯度洗脱线性洗脱分子浓度离子强度pH值（四）凝胶层析添加标题凝胶层析的基本原理添加标题凝胶介质的基本性质0102添加标题凝胶层析的基本操作添加标题凝胶介质的选用原则0304凝胶层析是以有一定孔径范围的多孔凝胶为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称分子筛。凝胶层析的基本原理小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部，迁移速度慢。原理：大分子物质不能进入凝胶颗粒内部，随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来，迁移速度快；分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度快。1分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙，即使大小不同，也不能分开，它们的下行速度慢。2注意：32、凝胶介质的基本性质1）葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶对碱稳定，在酸性环境中糖苷键易水解；湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的能耐受120℃高温。种类有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50表示1g干凝胶吸水量为5ml。SephadexLH是羟丙基化的Sephadex，流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤。PARTONE琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是从琼脂中分离出的天然凝胶，常见的有：Sepharose：Sepharose2B、4B、6B（数字代表干胶的百分