蛋白质核酸沉淀分离技术.pptVIP

缺点优点溶解度大123654价格便宜，废液不污染环境。缓冲能力弱，具腐蚀性，含N不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。分离效果好最常用的盐：硫酸铵加入固体盐法加入硫酸铵固体的量：查表、计算饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。适用：饱和度高，不增大溶液体积查表时注意温度123453、盐析的操作方法加入固体盐法20℃25℃g：加入固体硫酸铵的质量S2：所需达到的硫酸铵饱和度S1：原溶液的硫酸铵饱和度（2）加入饱和溶液法适用：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高。V：所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0：原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1：原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。（3）透析平衡法优点硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。缺点030102044、盐析曲线的制作方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃01各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）01以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线01蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％方法二各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％蛋白质量(mg)或酶活力硫酸铵饱和度％5、盐析的影响因素（1）离子强度与离子类型S：离子强度为I时蛋白质的溶解度；S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度；KS：盐析常数。盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系：当溶剂的温度一定时，对于某一溶质，S0是一常数β（溶解度常数）KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS；大而不规则的蛋白分子KS越大。KS主要取决于盐的性质：离子价数离子半径介电常数KS几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾硫酸钠磷酸铵柠檬酸钠硫酸镁1——纤维蛋白2——血红蛋白3——拟球蛋白4——血清蛋白5——肌红蛋白几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图KS分段盐析法在一定pH、温度条件下，改变离子强度。适用于早期粗提阶段的分步分离。Β分段盐析法在一定离子强度下，改变pH、温度。适于后期分离纯化和精制。（2）蛋白质浓度硫酸铵盐析法测定羧基肌红蛋白：蛋白质浓度g/L硫酸铵饱和度%结果3058开始沉淀366开始沉淀306590%沉淀析出当蛋白浓度增加10倍时，盐析时所需硫酸铵的饱和度约减小7%。适宜蛋白质浓度是2.5％～3.0％（25mg/mL～30mg/mL）pH的影响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。在水或稀盐溶液中测得的等电点与在高盐溶液中测得的等电点结果可能不一样注意（4）温度的影响温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大。但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。注意饱和度表中规定的温度；硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化；加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓；盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心；6、注意事项蛋白质等电点沉淀法是基于不同蛋白质离子具有不同等电点这一特性，依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最