蛋白质的修饰和表达课件.pptVIP

交錯延伸定向進化的篩選策略突變體分離瓊脂板塗布法在特殊條件下培養突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養基顏色、特定反應的出現等判斷是否具有目的基因微孔板懸浮法在含生色底物平板上培養，挑取具有活性的克隆接種到96孔板上檢測吸光度。使用微流控晶片微球細胞固定法與數字成像系統結合，將單個細胞附著在單個固體珠上，突變體進行分離和篩選流式細胞計數法細胞經螢光染色後，通過高速流動系統，排成單行，逐個通過流式細胞計數儀進行測定通過酶促反應的特徵加入底物顯色螢光共振能量轉移同位素標記底物通過檢測底物消耗或產物生成進行終點檢測酶檢測信號探測分光光度計和螢光酶標儀氣相色譜和高效液相色譜質譜和核磁定向進化與自然進化的異同點定向進化的實質是達爾文進化論在分子水準上的延伸和應用。定向進化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進化，使進化朝著人們需要的方向發展。兩者的不同：進化動力不同：保守突變非保守取代；進化方向不同：適應突變的積累；進化速度不同：非常漫長只需幾年、甚至幾天；進化目標不同：適應環境超越生物學意義的要求，探索所希望的蛋白質在順序空間的可及性。定向進化技術Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.目標酶所需功能方法結果實施菌種卡那黴素核苷基轉移酶熱穩定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用於有機溶劑易錯PCR+選擇在60％二甲基亞碸主僕女冠活力增強170倍枯草桿菌β-內醯胺酶作用於新底物DNA改組+選擇對cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對硝基苯酯酶有機溶劑中的底物特異性和活性易錯PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加1000倍大腸桿菌砷酸脫毒途徑砷酸抗性DNA改組+選擇抗性增加12倍大腸桿菌定向進化的應用改進的易錯PCR方法：MgCl2濃度增加到7mmol/L穩定非互補的堿基對；加入0.5mmol/LMnCl2降低聚合酶的特異性；dCTP和dTTP的濃度增加到1mmol/L促進錯誤摻入；TaqDNA聚合酶量增加到5U以促進延伸鏈在堿基錯配位置後得以繼續。Figure1Theroutineofstaggerextensionprocess結果產生間隔含不同範本序列的新生DNA分子Figure11Strategyoftheconstructionoftherecombinant蛋白質功能的全新設計蛋白質設計的目標是產生既能折疊為預想的結構和有用的功能。功能設計主要涉及鍵合及催化為達到這些目的可以採用兩條不同的途徑：反向實現蛋白質與工程底物的契合，改變功能；從頭設計功能蛋白質蛋白質的功能設計１．通過反向擬合天然蛋白質設計新的功能２．鍵合及催化的從頭設計３．在全新蛋白質中引入結合位點４．催化活性蛋白質的設計５．膜蛋白及離子通道的設計６．新材料的設計蛋白質修飾的化學途徑蛋白質修飾的分子生物學途徑第四章蛋白質的修飾和表達氨基的化學修飾三硝基苯磺酸與賴氨酸殘基反應，在420nm和367nm能夠產生特定的光吸收。亞氨代乙醯基：亞氨代乙醯化反應可區分α-氨基和ε-氨基。完全亞氨代乙醯化的蛋白質仍保持在水溶液中的可溶性。α-異硫氰酸苯酯在嚴格控制的條件下可對α-氨基進行相當特異性的修飾，而不作用於ε-氨基。羧基的化學修飾由於羧基在水溶液中的化學性知識的蛋白質分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修飾方法很有限，產物一般是酯類或醯胺類。水溶性的碳化二亞胺類特定修飾羧基基團，可在較溫和的條件進行氧化和還原反應