CRISPR基因编辑技术原理.pdf

CRISPR基基因因编编辑辑技技术术原原理理及及其其应应用用解解析析

一一、、CRISPR技技术术的的起起源源与与发发现现

CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）基因编辑技术的发现源于对细菌和古菌免系统的研

究。1987年，日本科学家在大肠杆菌基因组中首次观察到成簇的规律间隔短回文重复序列，但当时并未理解其功能。直到

2005年，生物信息学分析发现这些间隔序列与噬菌体或质粒的DA片段高度同源，暗示其可能参与原核生物的适应性免防

御。

2012年，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier团队在《Science》发表里程碑式论文，首次证明将CRISPR相关蛋白

（Cas9）与人工设计的单链向导RA（sgRA）结合，可在体外精确切割双链DA。同年，张锋团队成功将该系统应用于哺

乳动物细胞，标志着CRISPR-Cas9正式成为可编程的基因编辑工具。

二二、、CRISPR系系统统的的核核心心组组成成

1.Cas核核酸酸酶酶家家族族

Cas9是最早被工程化改造的核酸酶，其功能域包含：RuvC结构域：负责切割非互补链HH结构域：切割互补链PAM识别

域：识别特定短序列（如GG）其他变体包括：Cas12a（Cpf1）：识别T-richPAM，产生粘性末端Cas13：靶向RA分子

高保真变体：如SpCas9-HF1，通过点突变降低脱靶效应

2.向向导导RNA（（sgRNA））

由crRA（CRISPRRA）和tracrRA（反式激活RA）融合而成的人工RA，包含：20nt靶向序列：通过碱基配对识别

DA发夹结构：与Cas蛋白结合的关键区域支架序列：维持RA二级结构稳定性

3.原原型型间间隔隔序序列列邻邻近近基基序序（（PAM））

位于靶DA下游的短序列（通常为GG），其作用包括：决定Cas蛋白的切割位点区分宿主自身与外来DA影响核酸酶构象

变化

三三、、基基因因编编辑辑的的分分子子机机制制

1.DNA识识别别与与结结合合

sgRA通过碱基互补配对引导Cas蛋白至靶位点，此过程涉及：种子序列（Seedsequence）：sgRA第2-8位核苷酸决定特

异性R-loop形成：RA-DA杂交置换非互补链构象激活：PAM识别触发Cas蛋白活性位点暴露

2.双双链链断断裂裂（（DSB））的的产产生生

Cas9通过两个独立催化域切割DA：HH结构域切开互补链（靶链）RuvC结构域切开非互补链（非靶链）切割位点位于

PAM上游第3-4碱基对之间

3.DNA修修复复途途径径

细胞通过两种主要机制修复DSB：（1）非同源末端连接（HEJ）直接连接断裂末端易产生插入/缺失突变（Indels）适用于

基因敲除

（2）同源定向修复（HDR）依赖同源模板（外源供体DA）可实现精准编辑（点突变/基因插入）受细胞周期限制（S/G2

期）

四四、、技技术术优优化化与与创创新新

1.特特异异性性提提升升策策略略

高保真Cas变体：HypaCas9通过FokI二聚化增强特异性双切口酶系统：dCas9-FokI融合蛋白需两个sgRA配对化学修饰

sgRA：2-O-甲基化减少非特异性结合

2.功功能能扩扩展展工工具具

碱基编辑器（BaseEditor）BE4max：胞嘧啶脱氨酶融合Cas9实现C→T转换ABE8e：腺嘌呤脱氨酶实现A→G编辑Prime

Editing逆转录酶与nCas9融合，通过pegRA实现任意编辑可完成12bp的精准插入或替换

3.递递送送系系统统创创新新

病毒载体：AAV9用于体内递送，但容量受限脂质纳米颗粒（LP）：可封装mRA/sgRA复合物金纳米颗粒：通过基因枪

实现物理递送

五五、、应应用用领领域域突突破破

1.疾疾病病治治疗疗

遗传病：FDA批准首例CRISPR疗法Exa-cel（治疗镰刀型贫血）肿瘤免：敲除PD-1增强T细胞活性病毒感染：靶向HIV前病

毒DA的基因剪刀

2.农农业业改