杆状病毒AcMNPV中ME53的功能研究.pdf

中文摘要

草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）是严重威胁我国乃至世界玉米等粮食产业

的重要害虫之一，研发绿色、安全且高效的生物杀虫剂刻不容缓。苜蓿银纹夜蛾

核型多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus,

AcMNPV）是最早完成全基因组测序的杆状病毒。AcMNPV已广泛地应用于农业害

虫生物防治，但其存在杀虫效率较低等局限性，提高杆状病毒对草地贪夜蛾的杀虫

活性是当前需要解决的问题之一。

全面解析注释AcMNPV基因组中各基因的功能是改造提高AcMNPV抗虫活性

的前提。me53是AcMNPV上第139个开放阅读框，当敲除me53后AcMNPV出芽

型子代病毒BV（buddedvirus,BV）的增殖受到影响，表明ME53在AcMNPV增殖

中起重要作用。本课题通过开展两部分实验来明确AcMNPV侵染宿主草地贪夜蛾

Sf9细胞过程中ME53的功能，揭示其作用机制。获得的主要结果如下：

第一部分：重组病毒vAcme53KO-egfp、vAcme53KO-me53-egfp、vAc-me53-egfp、

vAcme53KO-me531-456-egfp、vAcme53KO-me53457-900-egfp、vAcme53KO-me53901-1347-egfp的

构建及ME53对AcMNPVBV增殖的影响

首先，利用搭桥PCR及λ-Red同源重组技术敲除了AcMNPV中me53基因，

在Bacmidme53KO-egfp的基础上，把me53全长以及截短片段构建在P10启动子下，

构建了回补me53的重组杆粒Bacmidme53KO-me53-egfp以及截短型重组杆粒

Bacmidme53KO-me531-456-egfp、Bacmidme53KO-me53457-900-egfp、Bacmidme53KO-me53901-

1347-egfp。利用Bac-to-Bac基因重组表达系统的Tn7转座子构建过表达me53的重组

杆粒Bacmid-me53-egfp。将构建的重组杆粒转染进其宿主Sf9细胞中获取重组病毒

vAcme53KO-egfp、vAcme53KO-me53-egfp、vAc-me53-egfp、vAcme53KO-me531-456-egfp、

vAcme53KO-me53457-900-egfp、vAcme53KO-me53901-1347-egfp，并结合荧光显微镜来观察绿

色荧光蛋白的表达情况，再通过Westernblot分析，表明以上重组病毒可有效地在

宿主细胞表达ME53-EGFP等蛋白，且表达量会随着感染时间的增加而增加。接

着，TCID50实验分析表明，vAc-me53-egfp处理组的子代病毒在12和72hp.i.增殖

能力比对照处理组vAc-egfp分别增加了8％和12％，且vAcme53KO-me53901-1347-egfp

处理组的病毒的增殖能力相较病毒vAcme53KO-me531-456-egfp、vAcme53KO-me53457-900-

I

egfp较弱。

第二部分：ME53在AcMNPV感染草地贪夜蛾宿主过程中的功能及机制分析

为了进一步揭示ME53在参与AcMNPV侵染草地贪夜蛾宿主细胞Sf9过程中的

功能以及作用机制，本部分对其侵染过程中的重要环节展开分析。首先，RT-qPCR

检测表明，过表达ME53能够提高早期转录活化因子ie1和ie2的转录水平，同时上

调核衣壳蛋白的构成和控制组装的基因38k和vp39的转录水平。接着，通过荧光定

位实验检测重组病毒侵染的Sf9细胞中的ME53的定位，结果显示，ME53-EGFP在

6hp.i.主要定位在细胞质中，而后在细胞核、质中均有分布。随后，通过在线服务

器同源建模和分子对接建立了ME53和GP64的互作模型，筛选出这两种蛋白存在

的互作氨基酸位点，模型中ME53与GP64间可以通过7对氢键发生互作。通