3.2基因工程的基本操作程序第1课时课件-高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

一、基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的筛选与获取，目的基因的获取方法?

1.PCR：名称、原理、仪器、条件、过程?

2.缓冲溶液中添加Mg2+的作用

3.用PCR可以扩增mRNA吗？

4.引物的作用？DNA复制的方向?

5.引物是什么？引物的种类？为何需要2种引物？

6.扩增n次需要多少个引物？至少需经过几次循环才能分离得到所需要的DNA区段？

7.鉴定PCR产物的方法？;第二步：基因表达载体的构建

1.基因表达载体的构建目的?

2.5个组成？标记基因的作用？复制原点的作用？启动子：本质？位置作用？什么

是诱导型启动子？终止子：本质？位置？作用？

3.构建过程？(3条)双酶切（两种不同的限制酶）分别切割目的基因和质粒，优势？

第三步：将目的基因导入受体细胞

1.转化的概念？导入的方法、受体细胞？

2.农杆菌转化法过程？(注意两次拼接、两次导入)、原理？

第四步：目的基因的检测与鉴定

1.检测与鉴定目的？分子水平检测什么？检测方法有？

2.个体生物学水平的鉴定方法？;基因工程的基本操作程序：;方法：①;②利用;;;条件：;;【注意】PCR反应过程中不存在边解旋边复制和半不连续复制;mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增(cDNA不含启动子和终止子，没有内含子只有外显子)。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。;PCR技术和体内DNA复制的比较;1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。;设计引物的主要原则

①引物长度通常为20~30个核苷酸,可防止随机结合。

②两个引物之间不能有连续4个碱基的互补配对,否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段。

③某一引物自身不能有大于4个碱基的反向重复序列或自身互补序列的存在,否则自身折叠出现局部碱基互补配对。

④为构建合适酶切位点,常常需要在2种引物的5端添加不同的限制酶??识别序列。

⑤设计的引物在合成之前,要在DNA数据库中进行BLAST检测,以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现,而与其他基因不具有互补性。

⑥PCR反应时复性温度和时间均与引物的序列有关,长度相同,但G、C含量高,需设定较高的复性温度。;2.若用PCR技术扩增psy基因,需要分别在不同的PCR扩增仪中加入种引物。

3.在利用PCR技术扩增某基因过程中,利用可寻找该基因的位置并进行扩增。

4.研制疫苗时,获取S蛋白基因(如图所示)选择的引物是。

5.利用PCR技术可以实现在体外快速大量DNA扩增，其与细胞内DNA复制的共同点是（答出２点）;[方法总结]

(1)引物的作用:引物需要互补结合在模板链的3端,为DNA聚合酶提供结合位点,使子链得以从5端向3端延伸。

(2)种类:2种;为了保证基因的两条反向平行的链都可以做模板,需要2种引物。

(3)结果:随PCR扩增的次数增加,2种引物中间的序列会被大量重复拷贝,进而方便后面的技术应用。

(4)应用

①合适的引物可仅扩增目的基因序列,能用于基因工程中目的基因的获取、检测和鉴定。

②不同的引物可结合不同的目的基因并进行扩增,能用于待测个体基因型的鉴定。

③引物序列与模板链的个别序列错配,依然可以获得PCR的扩增产物,能用于基因的定点诱变。;5.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？;;;;小结：一个含目的基因的DNA,复制n次：

①需要引物______种

②n次复制过程中共需引物___________个

③第n次复制需要引物_____个

④子代DNA中等长链DNA分子数__________个;;;;1.可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。;1.“SDS法”是提取DNA的常用方法,其提取液成分中的SDS能使蛋白质变性,EDTA是DNA酶抑制剂,Tris作为缓冲剂。下列说法错误的是()

A.SDS不会破坏蛋白质空间结构,但是能促进DNA和蛋白质分离

B.EDTA能减少DNA水解,提高DNA的完整性

C.Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定,保证DNA结构正常

D.若选择鸡血细胞为材料,则省去了研磨过程;2.热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是先将除TaqDNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加