血红蛋白的提取和分离经典.ppt

3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱5.收集缓冲液凝胶第59页，共93页，星期日，2025年，2月5日①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④再调整缓冲液面洗脱：⑤收集：待（）接近色谱柱底端时收集顶端样品完全进凝胶层红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动记第60页，共93页，星期日，2025年，2月5日4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）第61页，共93页，星期日，2025年，2月5日（1）、胶板的制备：①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干②.把玻璃板在灌胶支架上固定好第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日

（2）、分离胶的制备：

按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8)试剂双蒸水分离胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED 用量1.65mL1.3mL2.0mL0.05mL0.002mL 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日（3）、浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8)试剂双蒸水浓缩胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED用量1.46mL0.25mL 0.27mL0.02mL0.002mL 用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日（4）、取样取纯化后的血红蛋白样品10μL加入10μL上样buffer（内含少许溴酚蓝的40％蔗糖）混匀。第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日（5）装槽、点样：拔出梳子→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→在电泳槽中加入缓冲液→点样。第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）第27页，共93页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

（A为正面，B为剖面）

1：样品胶pH6.72：浓缩胶pH6.7

3：分离胶pH8.94：电极缓冲液pH8.310第28页，共93页，星期日，2025年，2月5日①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。第29页，共93页，星期日，2025年，2月5日【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日二、实验步骤蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析—去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日血液血浆水分其他物质：血浆蛋