基因克隆及蛋白表达.pptVIP

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。01010203优点：遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等；0203大肠杆菌表达系统RT-PCR是将RNA反转录和PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后进行常规PCR。Superscriptfirst-strandsynthesissystemforRT-PCR是从总RNA或mRNA合成cDNA。RNA量为1ng~5ug。cDNA合成ReverseTranscriptase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘1.依赖于RNA的5’?3’DNA聚合酶活性（反转录活性）；2.依赖于DNA的5’?3’DNA聚合酶活性。ReverseTranscriptaseRNADNADNARNaseH活性：特异性识别并分解RNA-DNA杂交体中的RNA链RT-PCR用M-MuLV反转录酶（RNaseH-）进行cDNA第一链的合成RNaseH缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA或者单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNaseH活性的缺失增强了该酶合成长链cDNA的能力。编码M-MuLV反转录酶的基因在重组大肠杆菌中表达，该酶在其RNaseH区域含一点突变，从而使修饰后酶的RNase活性缺失，但反转录功能不受影响。0102用M-MuLV反转录酶（RNaseH-）进行cDNA第一链的合成进行PCR前用RnaseH消化。去除与cDNA结合的RNA，增加PCR敏感性。第一链合成过程中RNaseH降解模板mRNA，导致全长cDNA合成减少及cDNA第一链产量降低。cDNA第一链的合成有三个方法omhexamers：是最非特异性引物。通常在特异全长mRNA难以拷贝时应用此引物。利用该方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR时，PCR引物决定其特异性。cDNA第一链的合成有三个方法oligo（dT）：较特异和常见的方法,其cDNA的合成数量和复杂性大大低于randomhexamers方法,尤其是进行新的mRNART-PCR时,建议用此方法.cDNA第一链的合成有三个方法Gene-specificprimer(GSP):最为特异的方法。利用邻近mRNA3’末端的PCR引物进行cDNA第一链合成,但是,某些GSP即使以DNA为模板,能扩增出DNA条带.有时,也不能进行cDNA第一条链合成.此时建议用oligo（dT）引物.cDNA第一条链合成步骤第三部分克隆RNA提取纯化RT-PCR质粒DNAPCR凝胶回收PCR扩增片段目的基因片段T-A克隆转化感受态细胞蓝白斑筛选质粒提取、酶切鉴定连入GST融合表达载体外源基因克隆到真核表达载体GST融合蛋白表达转化、活性测定转染真核细胞表达定位得到目的基因片段的T-A克隆PCR片段回收利用从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效快速的特点。本试剂盒纯化DNA片段纯度高，完整性好。可直接用于连接反应，PCR扩增。T-A克隆经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM-T质粒经EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然重要，但请一定注意信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用分段处理，对内容进行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。为了能让您有更直观的字数感受，并进一步方便使用，我们设置了文本的最大限度，当您输入的文字到这里时，已濒临页面容纳内容的上限，若还有更多内容，请酌情缩小字号，但我们不建议您的文本字号小于14磅，请您务必注意。单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的