实验3质粒的提取和鉴定.pptVIP

溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。挑单克隆E.coli菌株接种到4mlLB培养液中（含Amp50μg/ml），37℃225rpm振荡培养过夜。（活化菌种）从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）取4ml培养液至Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心30秒，弃上清，用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。步骤二质粒提取取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心30sec，弃上清。01用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。02将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10μl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。03加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3分钟。04加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。0112000r/min，4℃离心5min，将上清夜转至另一1.5mlEppendorf管中。02加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000rpm，4℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。03加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000rpm4℃离心5分钟。04壹倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。12000rpm，4℃离心2分钟。肆取样品10μl加2ul6×Loadingbuffer于1%琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。叁50μLTE缓冲液（含无DNase的RNase20μg/ml），使DNA完全溶解（-20℃保存）贰弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。************碱变性法小量提取质粒

DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组目的掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体掌握质粒酶切鉴定原理,学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子0102质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)12选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：01当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来02在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光限制性核酸内切酶:01一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’端为-OH。02限制性核酸内切酶分类识别切割特性催化条件是否