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食品中乳铁蛋白的测定酶联免疫吸附法

1范围

本文件规定了食品中乳铁蛋白测定的酶联免疫吸附法。

本文件适用于生乳、巴氏杀菌乳、调制乳、风味发酵乳、含乳饮料等含乳或添加乳成分液体食品，以及调制乳粉、婴幼儿配方乳粉、固体饮料等含乳或添加乳成分固体食品中乳铁蛋白含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3原理

利用抗原-抗体特异性结合反应，对样品中乳铁蛋白含量进行竞争性酶联免疫吸附测定。

标准品或样品中游离的乳铁蛋白与其酶标记物竞争性的结合微孔中预先包被的乳铁蛋白抗体结合位点。未结合的乳铁蛋白在洗涤步骤被除去。结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色产物。加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。标准品或样品中乳铁蛋白含量与吸光度值成反比，通过测定450nm波长下吸光度值和绘制标准曲线，计算得到样品中乳铁蛋白含量。

4试剂和材料

4.1乳铁蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒（EuroProximaLACTOFERRINFASTELISA）1参见附录A，或

与本标准检测原理相同且经等效验证的乳铁蛋白酶联免疫吸附检测试剂盒。

4.2纯水

根据GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

4.3空白婴幼儿配方乳粉

市售未添加且未标注含有乳铁蛋白的婴幼儿配方乳粉。

5仪器和设备

1给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效的产品。

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5.1酶标仪：450nm。

5.2分析天平：感量0.01g。

5.3涡旋混匀仪。

5.4微孔板振荡器。

5.5单道移液器：2μL~20μL，10μL~100μL，50μL~200μL，100μL~1000μL，500μL~5000μL。

5.6八道移液器：30μL~300μL。

6分析步骤

6.1试剂配制

6.1.11×稀释缓冲液：按照1:10比例稀释试剂盒中10×稀释缓冲液浓缩液，现配现用。如移取1.0mL

10×稀释缓冲液浓缩液到9.0mL水中稀释混匀。

6.1.21×洗涤缓冲液：按照1:20比例稀释试剂盒中20×洗涤缓冲液浓缩液，现配现用。如移取1.0mL

20×稀释缓冲液浓缩液到19.0mL水中稀释混匀。1个微孔需约1.0mL1×洗涤缓冲液洗涤。

6.1.3标准稀释工作液的配制：试剂盒标准品瓶中加入2.0mL1×稀释缓冲液（6.1.1），混匀，得到

浓度为2.5μg/mL的标准稀释工作液。400μL/管分装在洁净的1.5mL离心管中，储藏在-20°C条件下至试剂盒有效期结束。每次测定前取出1管回复至室温，即为标准稀释工作液7。

使用标准稀释工作液7进行其它梯度标准稀释工作液的配制：储藏在-20°C条件下的标准稀释工作

液7回复至室温后，点甩离心，按照表1用1×稀释缓冲液（6.1.1）逐级稀释并混匀。

表1梯度标准稀释工作液的配制

编号

浓度(μg/mL）

配制方法

标准稀释工作液1

0

200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液2

0.078

200μL标准稀释工作液3+200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液3

0.156

200μL标准稀释工作液4+200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液4

0.313

200μL标准稀释工作液5+200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液5

0.625

200μL标准稀释工作液6+200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液6

1.250

200μL标准稀释工作液7+200μL1×稀释缓冲液

标准稀释工作液7

2.500

标准品瓶中加入2.0mL1×稀释缓冲液

6.1.41×酶标记物：使用前点甩离心。用1×稀释缓冲液（6.1.1）按照1:100比例稀释试剂盒中100

×乳铁蛋白-HRP浓缩液，现配现用。样品数为X个，需配制1×酶标记物的体积为（7+X）×2×50μL+50μL。如样品数为1个，需配制850μL1×酶标记物，移取8.5μL100×乳铁蛋白-HRP浓缩液到841.5μL1×稀释缓冲液（6.1.1）中稀释混匀。

6.1.5试剂配制前