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食品中维生素B12的测定预包被微孔板式微生物法

1范围

本文件规定了食品中强化维生素B12的预包被微孔板式微生物测定方法。

本文件适用于饮料、糖果、调制乳粉、婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、特殊医学用途配方食品、片剂、胶囊、粉剂型保健食品的强化维生素B12含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

维生素B12是预包被在微孔中的莱士曼氏乳酸杆菌Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）生长所

必需的营养素。在一定控制条件下，在维生素B12测定培养基中，莱士曼氏乳酸杆菌的生长与待测试样中维生素B12含量呈线性关系，根据吸光度值与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中维生素B12的含量。

4试剂和材料

4.1预包被微孔板式维生素B12微生物法试剂盒（VitaFast@VitaminB12）1参见附录A，或与本标准检测原理相同且经等效验证的维生素B12检测试剂盒。

4.2除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682规定的二级水要求。

5仪器和设备

5.1水浴锅：95℃±1℃。

5.2恒温培养箱：37℃±1℃。

5.3均质器。

5.4超净工作台。

5.5离心机：≥3500×g。

5.6酶标仪：波长610nm~630nm或540nm~550nm。

5.7涡旋混合器。

1给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可以使用这些等效的产品。

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5.8电子天平：感量0.01g。

5.9微量可调单通道移液器及配套吸头：10μL~100μL、50μL~200μL、100μL~1000μL。

5.10无菌离心管：1.5mL~2mL、15mL、50mL。

5.11锥形瓶：500mL。

5.12容量瓶：100mL和1000mL。

5.13无菌注射器：10mL。

5.14无菌聚醚砜滤膜（PES）：0.22μm。

6分析步骤

6.1试样的制备

固体类试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm)；半固体食品试样需匀浆混匀；液体试

样用前振摇混合。

6.2试样的提取

6.2.1饮料

对固体饮料准确称量1.00g均质样品，对液体饮料移取1mL样品至50mL无菌离心管中，加水至

40mL，涡旋混匀后，用无菌注射器和无菌聚醚砜滤膜对样品液进行无菌过滤至2mL无菌离心管中。此为稀释倍数为40倍的样品液。

6.2.2糖果

称取15.00g~20.00g糖果至50mL无菌离心管中，加水至40mL，涡旋混匀后置95℃水浴30min

溶解样品，期间颠倒混匀至少5次，确保离心管紧闭。水浴结束后冰浴迅速冷却到30℃以下，将全部溶液转移至容量瓶中并定容至100mL。移取相当于1.00g样品的溶液至50mL离心管中（例如，取样量为17.00g，100mL/17.00g=5.88mL/g，相当于1.00g样品的体积为5.88mL），加至40mL，涡旋混匀，用无菌注射器和无菌聚醚砜滤膜对样品液进行无菌过滤至2mL无菌离心管中。此为稀释倍数为40倍的样品液。

6.2.3调制乳粉、婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、特殊医学用

途配方食品

称量1.00g均质样品至50mL无菌离心管中，加水至40mL，涡旋混匀后置95℃水浴30min，期

间颠倒混匀至少5次，确保离心管紧闭。水浴结束后冰浴迅速冷却到30℃以下，用无菌注射器和无菌聚醚砜滤膜对样品液进行无菌过滤至2mL无菌离心管中。此为稀释倍数为40倍的样品液。

6.2.4片剂、胶囊、粉剂型保健食品

准确称量1.00g均质后的片剂、胶囊或粉剂内容物至500mL锥形瓶中，加入400mL水混合均匀

后置95℃水浴30min，期间摇匀至少5次，水浴结束后冰浴迅速冷却到30℃以下。将全部溶液转移至容量瓶中用水定容至1000mL。取1mL