分子生物学技术.pptVIP

Tm值与核酸含量的关系20bpTm=4(G≡C)+2(A＝T)20bpTm=69.3+0.41(G≡C)%温度：温度过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。离子强度：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。但离子强度过高也不利于复性。杂交来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。影响核酸分子杂交的因素探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。离子强度：高离子强度溶液中，有利于杂交分子形成。温度：通常在低于Tm20-25℃的温度下进行杂交。添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂交的Tm。含30%—50%甲酰胺的杂交温度能降低到30—42℃。较低的杂交温度，使探针更稳定，并能更好地保留非共价结合的核酸。为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。预杂交常用于预杂交的封闭物变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。二、核酸探针指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。核酸探针的类型：寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、单链DNA探针。常用的探针标记物：放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）。核酸分子杂交信号的检测0102放射性同位素标记探针：放射自显影。非放射性同位素标记探针：偶联反应+显色反应。核酸分子杂交技术固相杂交：结合于某种固相支持物上的待测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中进行杂交反应。膜上印迹杂交将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程称为膜上印迹杂交。印记的方法：虹吸印迹法；真空转移法；电转移法DNA或RNA添加标题↓添加标题杂交信号检测添加标题↓添加标题电泳分离核酸片段添加标题↓添加标题转移至固相支持物（印迹技术）添加标题↓添加标题杂交添加标题↓添加标题洗去未杂交探针添加标题Northern杂交原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经过杂交，分析mRNA的大小及含量。应用：半定量分析mRNA的含量；确定mRNA分子的大小。方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量→变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂交→洗膜→压片→洗片→图像分析Western印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。适于核酸样品定量检测。用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。原位杂交取材添加标题↓添加标题观察结果添加标题↓添加标题组织、细胞固定添加标题↓添加标题预杂交添加标题↓添加标题杂交添加标题↓添加标题放射自显影或免疫酶法显色添加标题（三）液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法待测RNA样品↓液相杂交↓DNA-RNA杂交双链↓酶解↓杂交体系纯化↓脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳↓放射自显影核酸酶S1（专一降解未杂交的DNA和RNA单链）←←单链DNA探针（M13体系合成）待