分子标记技术及其应用ISSR.pptVIP

Chapter10ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)在SSR标记技术中，采用PCR反应必须知道扩增DNA片段两侧序列，在大多数情况下，某些序列本身或其旁测序列并不清楚，而且由于SSR两侧引物具有物种特异性，引物设计费时耗力，要检测多个基因座是不现实的。这就限制了PCR技术的应用，“锚定PCR（anchoredPCR）”可克服上述障碍。锚定简单重复序列（anchoredsimplesequencerepeat，ASSR），也称作简单重复序列间区（inter-simplesequencerepeat，ISSR）标记技术或者以微卫星为引物的PCR（microsatellite-primedPCR,MP-PCR）技术。10.1IntroductionISSR标记技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3ˊ端或5ˊ端加上2～4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。10.2PrincipleofISSR锚定ISSR-PCR示意图5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)n3′锚定引物的PCR产物5′锚定引物的PCR产物用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5′端或3′锚定1至数个碱基。10.3CharacteristicAdvantages：ISSR遗传多态性高，重复性好。（17～24bp）符合孟德尔遗传规律。无需知道任何靶标序列的SSR背景信息。DNA用量少disadvantages：PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸索。ISSR标记大多是显性标记DNAextractionandpurification4ProcedurePrimerdesignISSR引物常为5′端或3′加猫（2～4个碱基）的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸序列，重复次数常为4～8次。PCRamplification6％PAGEDetectofPCRproductandstatisticalanalysis扩增步骤与RAPD相似，但不同引物、不同材料的扩增条件有异。Primer0.2～0.8μmol/LTemplateDNA5～50ngTaqDNApolymerase0.4～1U需要做预备实验优化PCR条件，以获得清晰、可重复，易统计的条带。25μl0.5～2.0%AgarosegelelectrophoresisEBstainingSilverstainingyes1No0PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂和加速剂的配伍如下表：聚合反应催化剂配伍引发剂加速剂（NH4)2S2O8TEMED（NH4)2S2O8DMAPN核黄素TEMEDNote：(NH4)2S2O8，过硫酸胺TEMED：N，N，N，N‘;四甲基乙二胺DMAPN：β－二甲基胺基丙晴用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，称光聚合反应。大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。01某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。02某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。03温度高聚合快，温度低聚合慢。以上几点在制备凝胶时必须加以注意。04聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响PouringAcrylamideGelsPreparationofglassplatesWashtheglassplatesthoroughly