《SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳》教学课件.pptVIP

结束语SDS是蛋白质研究中一种常用的技术，希望通过本课件的学习，能够帮助大家更好地理解和掌握SDS的基本原理和操作方法。**********************SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳教学课件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本概念概念SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分离蛋白质的方法，基于蛋白质的分子量大小进行分离。原理在SDS和还原剂的作用下，蛋白质变性并带负电荷，在电场作用下，蛋白质按分子量大小分离。SDS聚丙烯酰胺凝胶的组成聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺聚合而成，形成多孔网状结构。SDS阴离子表面活性剂，使蛋白质变性并带负电荷，消除蛋白质自身的电荷差异。还原剂如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质完全变性。溶胶的制备溶液配制根据实验要求，准确称取所需的试剂，并用蒸馏水溶解，配制成所需的浓度。过滤除菌将溶液用滤纸过滤，去除溶液中的杂质和细菌，确保溶液的纯净度。溶液混合将配制好的溶液充分混合，确保试剂完全溶解，形成均匀的溶液。凝胶的制备1将配制好的溶液，按照比例混合，并加入适量的催化剂，如过硫酸铵和TEMED。2将混合好的溶液轻轻摇匀，使其充分混合，并避光保存，防止催化剂分解失效。3在室温下，溶液会逐渐聚合，形成凝胶，凝胶的硬度取决于丙烯酰胺和交联剂的浓度。凝胶的浇铸准备玻璃板将洁净的玻璃板，用酒精擦拭，并用清水冲洗干净，确保玻璃板没有油脂或其他杂质。组装凝胶槽将玻璃板插入凝胶槽中，并用夹子固定，确保玻璃板密封，防止溶液泄漏。浇铸凝胶将配制好的溶液，缓缓注入凝胶槽中，并用尖头滴管去除气泡，确保凝胶均匀无气泡。样品的制备1样品处理将样品溶解在SDS样品缓冲液中，并在沸水中煮沸，使蛋白质变性并带负电荷。2样品上样将处理好的样品，用微量移液器吸取，并小心地将其加入凝胶槽的样品孔中。3样品电泳将凝胶槽插入电泳仪中，并接通电源，进行电泳，分离蛋白质。电泳缓冲液的制备1配制溶液根据实验要求，准确称取所需的试剂，并用蒸馏水溶解，配制成所需的浓度。2溶液混合将配制好的溶液，充分混合，确保试剂完全溶解，形成均匀的溶液。3过滤除菌将溶液用滤纸过滤，去除溶液中的杂质和细菌，确保溶液的纯净度。电泳仪的组装1连接电源将电泳仪连接到电源，并确保电源电压和电流符合实验要求。2放置凝胶槽将凝胶槽插入电泳仪中，并用夹子固定，确保凝胶槽与电泳仪连接良好。3加入缓冲液将电泳缓冲液加入电泳仪的缓冲液槽中，确保缓冲液的液面完全覆盖凝胶。电泳的实施样品上样将样品小心地加入凝胶槽的样品孔中，避免样品溢出。接通电源接通电泳仪的电源，并设置合适的电压和电流，进行电泳。观察电泳在电泳过程中，要密切观察电泳的进展情况，并及时调整电压和电流。电泳时电压的控制电压设定根据凝胶浓度和实验要求，设定合适的电压，一般在50-200伏之间。电压监控在电泳过程中，要密切监控电压的变化，确保电压稳定，避免过高或过低。电泳时电流的监控电流稳定电流应保持稳定，避免过大或过小，过大的电流会产生过热，影响电泳结果。电流变化如果电流突然发生变化，要及时检查电泳系统，排除故障。电泳时温度的调控电泳结束后的凝胶取出凝胶取出电泳结束后，将凝胶从凝胶槽中取出，并用清水冲洗干净。凝胶保存如果需要保存凝胶，可以将凝胶浸泡在固定液中，并置于冰箱中保存。凝胶的染色1将凝胶浸泡在染色液中，使蛋白质与染色液结合，形成有色物质。2染色时间要根据染色液的浓度和实验要求，一般在30分钟到1小时之间。3染色结束后，将凝胶用清水冲洗干净，去除多余的染色液。凝胶的脱色脱色方法将凝胶浸泡在脱色液中，去除背景染色，使蛋白质条带更加清晰。脱色时间脱色时间要根据脱色液的浓度和实验要求，一般在30分钟到1小时之间。脱色效果脱色结束后，观察凝胶，如果背景颜色过深，需要继续脱色。凝胶的拍照记录1背景消除将凝胶置于背景消除装置中，消除背景杂光，使蛋白质条带更加清晰。2凝胶拍照使用凝胶成像仪或数码相机，对凝胶进行拍照，记录蛋白质条带的分布和大小。3图像保存将拍照得到的图像保存到电脑中，以便后续分析和处理。分子量标准蛋白的鉴定标准蛋白分子量标准蛋白是已知分子量的蛋白质，用于对未知蛋白质进行分子量估算。标准曲线通过电泳分离标准蛋白，并在凝胶上进行染色，绘制标准蛋白的迁移距离与分子量的关系曲线。样品蛋白质的分子量估算1迁移距离测量未知蛋白质在凝胶上的迁移距离。2标准曲线根据标准曲线，查找到与该迁移距离对应的分子量。3