酶与细胞的固定化技术 (2).ppt

************(1)将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原）；(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶－抗体－抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。酶联免疫测定第63页，共64页，星期日，2025年，2月5日*感谢大家观看第64页，共64页，星期日，2025年，2月5日************************************************************固定化酶性质固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。最适温度：一般与游离酶相似。最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载体带电性能而变化。第31页，共64页，星期日，2025年，2月5日固定化酶操作的注意事项活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。第32页，共64页，星期日，2025年，2月5日分类方式固定化细胞分类方式固定化细胞细胞类型微生物植物动物生理状态死细胞:完整细胞,细胞碎片,细胞器活细胞:增殖细胞,静止细胞,饥饿细胞细胞的固定化方法第33页，共64页，星期日，2025年，2月5日1)直接固定法不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。2)吸附法3)包埋法2.固定化方法第34页，共64页，星期日，2025年，2月5日与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。（1）有活性升高的现象。（2）稳定性的增加。（3）最适温度和最适pH常保持不变。固定化细胞的特点第35页，共64页，星期日，2025年，2月5日固定化酶（细胞）的评价指标（一）固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。通常采用间歇测定和连续测定方法。蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法)；2）考马斯亮蓝法。半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。第36页，共64页，星期日，2025年，2月5日如果耦联率与酶活力回收率相近，则表明固定化方法对酶活力没有明显影响。固定化酶（细胞）的评价指标（二）偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%相对活力=固定化酶总活力/(加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%第37页，共64页，星期日，2025年，2月5日乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1.氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶第38页，共64页，星期日，2025年，2月5日泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第39页，共64页，星期日，2025年，2月5日2.葡萄糖异构酶世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。第40页，共64页，星期日，2025年，2月5日二、固定化酶在医学上的应用1.消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分