SDSPAGE全细胞蛋白电泳.pdf

2.2.5SDS全细胞蛋白电泳

提取蛋白质：用Ependorf管离心收集菌体（对数生长期），称其重量，并用

样品缓冲液（samplebuffer）裂解细胞，使其浓度达到150mgml-1，放入-20℃冰

箱中，临用前在95℃下加热10min，并以4000rpm/min离心2min，待用。

电泳：用DYCZ-24D双垂直电泳槽，10%的分离胶，5%的浓缩胶。先灌分

离胶，等其凝固后再灌入浓缩胶，同时插好梳子。电泳前将2.1.2.5中样品取出

溶化后在95℃下加热10min放在冰上冷却后即可点样，第一个孔点buffer，第二

个孔点marker，其余每孔点样7l，电泳时恒流30mA，视其指示剂溴酚兰到达

胶的底端为止。

胶的染脱色及判读：电泳完把胶取下放在大小适合的盒子里，放入染色液在

37℃摇床振荡30min，然后用脱色液脱色，遵循少量多次原则（约5次），直到

背景蓝色褪去。把胶放在紫外成像仪上照相观察，把条带相同的归为一类。

所需试剂：

样品缓冲液：4ml水；1ml0.625MTris-HCl，pH6.8；0.8ml甘油；1.6ml

10%SDS；0.4ml-巯基乙醇；0.2ml1%百里溴酚兰。

电泳缓冲液：3.03gTrisbase，14.41g甘氨酸，1gSDS；加水到1000ml；

pH8.4+0.1。

下胶缓冲液：18.17gTrisBase，2ml20%SDS溶液，pH8.8，加水到100ml。

上胶缓冲液：6.06gTrisBase(1.5M),2ml20%SDS溶液，pH6.8，加水到100

ml。

10ml10%分离胶：2.5ml下胶缓冲液；3.4mlH2；4.1mlAcry/biscrylamide

(24.2%,30:1);30l10%的过硫酸铵;20lTEMED。

5ml5%浓缩胶：1.25ml上胶缓冲液;2.25ml水;1ml

Acry/biscrylamide(24.2%);30l10%的过硫酸铵;20lTEMED。

染色液：2.2g考马斯亮兰，400ml甲醇，80ml乙酸，400ml水。

褪色液：10%乙酸+30%甲醇+60%水。

2.2.6序列测定

正向引物25f(5-AACT(G/T)AAGAGTTTGATCCTGGCTC-3)和反向引

物1492r(5-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3)，反应体系及条件见

考文献（Tanetal,2001）；测序所用引物为342fc(5-CTCCTACGGGAGGCA

G-3),（引物均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成）。对一些菌株16

rDNA的部分序列进行了测定，将所得序列在GeneBank的数据库中进行Blast，

找到最大相似性的菌株。以提取的DNA为模板扩增出16rDNA，经纯化后交

由公司测序。PCR反应条件是97℃预变性5min，97℃变性50s，56℃退火45

s，72℃延伸80s，总共进行35个循环，72℃延伸5min。

测序所用引物为35fc(5-CTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATT

GAACG-3)、342fc(5-CTCCTACGGGAGGCAG-3)和930fc(5-GGTTAAAAC

TYAAAKGAATTGACGGGGAC-3)。序列分析采用软件CLUSTALX进行比对

(alignment)后，再用软件GeneDoc进行人工比对和格式转换。最后用TREECONW

进行邻近法(neighbor-joiningmethod)聚类分析并构建系统发育树。